分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)

1、第一部分-从头合成质粒 单片段克隆 多片段克隆 第二部分-已有质粒改造 突变 缺失 插入,分子克隆之同源克隆方法,从头合成质粒 之 单片段克隆,用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段,从cDNA做PCR获取包含目的基因CDS序列的片段,含目的基因片段的质粒,单片段克隆流程图,目的质粒,同源反应,PCR产物纯化,目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化,+,转化,5,3,5,3,3,5,cDNA,质粒,5,3,3,5,正向引物(实线),反向引物(实线),目的基因片段,PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段,PCR获取包含目的基因CDS序列的片段,目的基因片段,质粒同源序

2、列（15-20bp）,质粒同源序列,CDS区域,单片段克隆原理图一,与基因互补序列（18-27bp）,5,3,3,5,3,5,5,3,线性化载体,目的质粒,同源反应示意图,3-5外切酶活性,PCR产物纯化,目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化,+,单片段克隆原理图二,PCR反应体系(Takara PrimeSTAR),PCR仪设置,*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒),*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化,PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例),同源反应体系(标准版),同源反应体系(简便版),同源反应体系（Vazyme产品）,*

3、同源反应37 30min，后置于冰上5min *同源反应产物全部用于转化 100L感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态) *同源反应产物可保存于-20,*已线性化质粒： pCDHEF1MCSIRESneo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 ,从头合成质粒 之 多片段克隆,用包含同源序列的引物做PCR扩增出含同源序列的片段1,从cDNA PCR获取包含目的片段1,含目的片段1的质粒,目的质粒,同源反应,片段1 PCR产物纯化,目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化,片段2 PCR产物纯化,片段3

4、PCR产物纯化,+,+,+,+,转化,多片段克隆流程图,线性化载体,目的质粒,多个片段PCR及其产物纯化,目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化,+,引物设计,同源反应,多片段克隆原理图（方法一）-更适用于单个位置突变数较多,突变位点设计在同源序列内,线性化载体,目的质粒,多个片段PCR及其产物纯化,目的载体线性化（PCR或酶切）及纯化,引物设计,同源反应,+,多片段克隆原理图（方法二）-适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变,突变位点设计在同源序列内,PCR反应体系(Takara PrimeSTAR),PCR仪设置,*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒),*扩增条带特

5、异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化,PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例),同源反应体系(标准版),同源反应体系（Vazyme产品）,*同源反应37 30min，后置于冰上5min *同源反应产物全部用于转化 100L感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态) *同源反应产物可保存于-20,*已线性化质粒： pCDHEF1MCSIRESneo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 ,已有质粒改造 之 突变,以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒,目的质

6、粒,同源反应,PCR产物纯化,转化,质粒突变流程图,质粒突变原理图一,第一轮PCR示意图,第二轮PCR示意图,第二轮PCR线性化示意图,引物（实线）,需突变区域（渐变色）,质粒突变原理图二,第三轮及之后PCR示意图,同源反应示意图,目的质粒,第三轮及之后PCR线性化示意图,PCR反应体系(Takara PrimeSTAR),PCR仪设置,*建议模版量小于10ng,*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至35Cycles,PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例),同源反应体系(标准版),同源反应体系(简便版),同源反应体系（Vazym

7、e产品）,*同源反应37 30min，后置于冰上5min *同源反应产物全部用于转化 100L感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态) *同源反应产物可保存于-20,已有质粒改造 之 缺失片段,以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒,目的质粒,同源反应,PCR产物纯化,转化,质粒片段缺失流程图,质粒片段缺失原理图一,第一轮PCR示意图,第二轮PCR示意图,第二轮PCR线性化示意图,引物（实线）,需缺失区域（紫色）,质粒片段缺失原理图二,第三轮及之后PCR示意图,同源反应示意图,目的质粒,第三轮及之后PCR线性化示意图,PCR反应体系(Takara PrimeSTAR

8、),*建议模版量小于10ng,PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例),PCR仪设置,*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至35Cycles,同源反应体系(标准版),同源反应体系(简便版),同源反应体系（Vazyme产品）,*同源反应37 30min，后置于冰上5min *同源反应产物全部用于转化 100L感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态) *同源反应产物可保存于-20,已有质粒改造 之 插入片段,以质粒为模版用包含同源序列的引物做PCR，扩增得到线性质粒,目的质粒,同源反应,PCR产物纯化,转化,质粒插入片段流程图,质粒插入片段原理图一,第一轮PCR示意图,第二轮PCR示意图,第二轮PCR线性化示意图,引物（实线）,需插入区域（渐变色）,质粒插入片段原理图二,第三轮及之后PCR示意图,同源反应示意图,目的质粒,第三轮及之后PCR线性化示意图,PCR反应体系(Takara PrimeSTAR),*建议模版量小于10ng,PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例),PCR仪设置,*扩增条带特异时无需切胶回收，可直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至35Cycles,同源反应体系(标准版),同源反应体系(简便版),同源反应体系（Vazyme产