香豆素分析ppt课件

1、cpusyj,香豆素分析,概述,香豆素及其衍生物是中药中的主要成分之一，具有多种生理活性，临床上用于止咳、利尿、抗菌、抗放射、抗凝血等。,香豆素分析,举例,定量分析,定性分析,定义、分布、性质,第一节 结构、分布、理化性质,香豆素从结构上可看成是顺式的邻羟基桂皮酸脱水而成的内酯，基本母核为苯并-吡喃酮。 分子中苯核或- 吡喃酮环上常有取代基存在，如羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基等,一、结构,香豆素按结构分为,简单香豆素只在苯环上有取代基的 呋喃香豆素 线型（6、7）； 角型（7、8） 吡喃香豆素线型（6、7）； 角型（7、8） 其他香豆素 吡喃酮环上有取代基的,（一）简单香豆素类,基本结构即苯并

2、-吡喃酮。 苯环上常见羟基、甲氧基、亚甲二氧基和异戊烯基等取代基。,伞形花内酯 七叶内酯 R = H 滨蒿内酯 七叶苷 R = glc,（二）呋喃香豆素类,基本结构为香豆素母核苯环与呋喃环稠合，根据稠合位置可分为线型与角型。,16,7-呋喃香豆素（线型）,C6、C7位与呋喃环稠合（6位异戊烯基与7位羟基环合，降解失去三个碳原子）的衍生物，称为线型。,补骨脂内酯 花椒毒内酯 紫花前胡内酯,27,8-呋喃香豆素（角型）,C7、C8位与呋喃环稠合（8位异戊烯基与7位羟基环合）的衍生物，称为角型。,异补骨脂内酯 茴芹内酯 异佛手内酯,（三）吡喃香豆素类,基本结构为香豆素母核苯环与吡喃环稠合，也分为线型

3、和角型。,16,7-吡喃香豆素（线型）,C6、C7位与吡喃环稠合（6位异戊烯基与7位羟基环合）的衍生物。,花椒内酯,美花椒内酯,27,8-吡喃香豆素（角型）,C7、C8位与吡喃环稠合（8位异戊烯基与7位羟基环合）的衍生物。,邪蒿内酯,黄曲霉素B1,（四）其他香豆素类,具有抗凝血作用的紫苜蓿酚(sativol)属双香豆素类；茵陈炔(capillone)属异香豆素类。,紫苜蓿酚,茵陈炔,二、 分布,香豆素类成分广泛分布于植物界，如伞形科、夹竹桃科、萝藦科、菊科、十字花科、杜鹃花科、豆科、唇形科、兰科、禾本科、芸香科、蔷薇科、茄科、无患子科、瑞香科等植物中均有较多分布。 含有香豆素类化合物的常用中药

4、有白芷、秦皮、独活、前胡、阿魏、当归、补骨脂、茵陈蒿、川芎、防风、蛇床子等。,三、理化性质,通性,1,与碱的反应,2,显色反应,3,荧光与紫外吸收,4,多具芳香气，能随水蒸气挥发或升华。 不溶于水或难溶于水，可溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿或乙醇等溶剂中；一般含氧取代基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解度比较小，冷的情况下更小。 在定量测定时，多用氯仿和乙醇来提取。,通性,1,与碱的反应,2,香豆素类化合物分子中具,-不饱和内酯结构，具有内酯化合物的通性。如在稀碱性条件下加热可水解开环，生成易溶于水的顺式邻羟基桂皮酸盐。酸化后又闭环恢复为亲脂性内酯结构。 与碱液长时间加热，顺式邻羟基桂皮酸盐则发生双

5、键构型的异构化，转变为稳定的反式邻羟基桂皮酸盐，此时，再经酸化也不能环合为内酯。,顺式邻羟基桂皮酸 反式邻羟基桂皮酸,显色反应,3,（1）异羟基肟酸铁反应： 因香豆素具有内酯环，所以能与异羟基肟酸铁反应，产生紫红色，可被用来鉴别和比色测定，其反应如下：,（2）酚类试剂反应： 因该类化合物多具酚羟基，能和常规酚类试剂反应，如三氯化铁、硝酸银的氨溶液、三氯化铁- 铁氰化钾。 如果香豆素化合物的C6位上（即酚羟基的对位）没有取代基，则能和 Emerson试剂反应现橙红色；与Gibbs试剂反应现蓝色。 Emerson反应是将香豆素类化合物溶于碱性溶液中，加入2% 4- 氨基安替比林溶液数滴及8%铁氰化

6、钾溶液23滴即可显色，其反应如下：,荧光与紫外吸收,4,*,（1）香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光，不但作为定性鉴别，而且作为定量测定依据。 但具有荧光的化合物不一定都是香豆素，如咖啡酸、绿原酸等在UV下也能呈现蓝色荧光，二氢黄酮则呈天蓝色荧光。 此外，个别的香豆素类化合物（如双香豆素）不产生荧光。,（2）羟基香豆素在紫外光下有强的荧光，不难辨认；呋喃香豆素较弱，但也能在紫外光下显示蓝、紫、棕、绿、黄等色。必要时可喷10% KOH醇液，或20% SbCl3氯仿液以显色。 （3）香豆素类化合物羟基和芳环形成的共轭体系具较强的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物在不同pH条件下表现不同的光谱特

7、性，对该类成分的分析具重要意义。,定性分析,化学定性分析： 荧光法 显色反应,色谱定性分析： 薄层色谱法 高效液相法 气相色谱法,第二节 香豆素定性分析,化学定性方法：,1荧光反应 （1）秦皮的鉴别 取秦皮，加热水浸泡，浸出液在日光下可见碧蓝色荧光。 （2）前胡的鉴别 取前胡粉末1g，加乙醚10ml，浸渍2h后，取乙醚液2 滴，分别点于两张小滤纸片上，置紫外光灯（365nm）下观察，显淡天蓝色荧光。然后滴加15氢氧化钠溶液数滴，2 min后荧光消失。将一张滤纸片避光保存，另一张滤纸片曝光，约3h后，置紫外光灯（365nm）下观察，曝光者天蓝色荧光加强，避光者不显荧光。,2颜色反应 （1）蛇床子

8、的鉴别 取蛇床子粉末2g，加乙醇20ml，加热回流30min，滤过。取滤液数滴，点于白瓷板上，置紫外光灯（365nm）下观察，显蓝紫色荧光； 另取滤液 2ml，加等量的3碳酸钠溶液，加热5min，放冷，再加新制的重氮对硝基苯胺试液12滴，即显樱红色。,（2）白芷的鉴别 取少量样品粉末，加乙醚，振摇5min后静置20min，取上清液 1ml，加入7%盐酸羟胺甲醇溶液23滴，20%KOH甲醇溶液23滴，摇匀，在水溶上微热，冷却后加稀盐酸调到pH 3 4，然后加入1%三氯化铁乙醇溶液12滴，溶液显紫红色。,1应用特点 薄层色谱法可用于含多类成分的中药的鉴别，可用标准品或标准药材对照，再与上述荧光反应

9、、颜色反应配合，即可方便、快速鉴别含香豆素类化合物的中药。 因香豆素类成分大都具荧光，含香豆素类中药提取物，在硅胶板上的色谱指纹图具一定的鉴别意义， 可用化学对照品对照； 可以使用经准确鉴定学名的标准药材做对照品；,薄层色谱法,硅胶薄层色谱常用的展开系统有： 氯仿； 含1.5%乙醇氯仿； 乙醚- 苯（1：1）； 乙醚- 苯- 10%乙酸（1：1：1）等,2、应用实例,白芷的薄层定性分析 取白芷粉末0.5g，加乙醚10ml，浸泡1h，时时振摇，滤过，滤液挥干乙醚，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取欧前胡素、异欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液

10、。 吸取上述两种溶液各4l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（3060）- 乙醚（3：2）为展开剂，在25以下展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点。,第三节 香豆素定量分析,含香豆素成分的中药定量测定方法有比色法、荧光法、极谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等。 每种方法都有其特点，有的简单，有的操作麻烦，有的则需要一定的仪器设备。 相比之下，因该类成分多具有较强的荧光，故可荧光分光光度法进行定量分析；薄层扫描法测其紫外吸收或荧光的方法较简便快速，兼有分离功能，应用

11、日趋普遍；近年来又有了分离效率较高的高效液相色谱技术，对复杂的中药样品更为合适。,一荧光分光光度法,香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光，可用荧光分光光度法测定。如 7- 羟基香豆素和香豆素混合物的测定，前者用370nm激发，在450nm测定，浓度为110gml时荧光与浓度成线性失系。后者用361nm激发，在491nm测荧光。 如果香豆素7位上有乙氧基（代谢产物）可使其变为7- 羟基香豆素用390nm激发，440nm测定。,1、应用概况,2应用实例,（1）佛手油中的香豆素分析 可用硅胶GF254薄层分离，以己烷- 醋酸乙酯（3：1）展开，分出4个荧光点即：柠美内酯（Citropten）；5

12、- 牻牛儿氧基-7-甲氧基香豆素（5-geranyloxy-7-methydroxycoumarin）；佛手内酯和佛手柑亭（bergamottin），可直接在薄层上进行荧光测定，对于和用330nm激发，424nm测定荧光，和用272nm激发，520nm测定。,二薄层色谱法,1荧光扫描法测定蛇床子中蛇床子素含量 精密称取在P2O5干燥器中减压干燥至恒重的蛇床子粉末1g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，振摇后放置过夜，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取上述两种溶液各1l，分别交叉点于同一硅胶薄层板上，以苯-

13、 乙酸乙酯（30：1）为展开剂，展开，取出，晾干。 照薄层色谱法进行荧光扫描，激发波长X365nm，测量供试品与对照品荧光强度积分值. 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于1.0 。,2紫外光区扫描法测定独活中蛇床子素含量 取独活粗粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇20ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液置25ml量瓶中，用少量乙醇分次洗残渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取供试品溶液2l、对照品溶液1l与2l，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯

14、（30：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视定位，照薄层色谱法进行扫描，s322nm，R370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于0.30%。,三、高效液相色谱法 1白芷中3种香豆素的测定 测定氧化前胡素（oxypeucedanin，），欧前胡素（imperatorin，）和异欧前胡素（isoimperatorin，），其方法是：准确称取、标准品各5mg，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，分别取此溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，均用乙酸乙酯定容至10m1，制得 6个不同浓度的标

15、准溶液。,按下述条件进行HPLC分析：以-Bondapak C18柱为色谱分离柱，加预柱以防样品污染分析柱，流动相为甲醇- 水（70：30），流速1.0mlmin，UV 254nm检测各组分峰，进样10l，以峰面积为纵坐标，各成分浓度为横坐标，得3条通过原点的直线，线性范围0.005 0.05mgml，其回归方程如下： 氧化前胡素 Y = 1521X + 25.40， r = 0.999 欧前胡素 Y = 1953X + 76.53， r = 1.000 异欧前胡素 Y = 1930X + 53.73， r = 0.999 精密称取白芷粉（40目）2g，置索氏提取器中，用乙醚提取9h，回收乙醚

16、，真空干燥，残渣溶于乙酸乙酯并定容成25ml，经Millipore样品过滤器过滤，同上色谱条件测定。标准品与样品分离情况（见图 13-1）较好。,四其它定量分析方法,（一）比色法 （1）该方法基于香豆素类化合物的内酯环官能团和苯环上的羟基的性质，选择适当的显色剂反应产生颜色来进行比色的方法。如异羟肟酸铁、4- 氨基安替比林或氨基比林、三氯化铁、三氯化铁- 铁氰化钾、磷钼酸、磷钨酸。 例如短茶素片中岩白菜素的测定,（2）如果酚羟基的对位或邻位未被取代，在碱性溶液中则能和重氮化的对氨基苯磺酸反应生成紫色或红色。 如佛手内酯（bergapten）、伞花内酯（umbelliferone）都能和重氮化对

17、氨基苯磺酸反应呈色。,（3）若香豆素衍生物C6位上没有取代基，则能与Gibbs试剂反应生成蓝色。,（二）紫外分光光度法,1应用原理 （1）香豆素类衍生物的紫外吸收光谱一般表现为min244士4nm（log3.26 3.54）；max275士4nm（log3.98 4.10）；min300士5nm（log3.52 3.8）；max315士8nm（log3.70 3.95）。 （2）如果分子中有羟基存在，特别在 C6或 C7上，其主要最大吸收峰向红位移。,（3）呋喃香豆素的吸收峰向紫位移，它的max在 220 230nm及250nm。 （4）pH影响：在碱性溶液中香豆素的最大吸收峰位置较其在中性或

18、酸性溶液中多数有显著地向红位移现象，且吸收系数也有所增大。例如伞形花内酯max325nm（log4.15），但在碱性溶液中，其max 372nm（log4.23）。,秦皮,秦皮为木犀科植物白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.、苦栃白蜡树F. rhynchophylla Hance、尖叶白蜡树F. chinensis Roxb. var. acuminata Lingelsh.、宿柱白蜡树F. stylosa Ungelsh .等的干燥树皮或干皮。具清热燥湿、收涩明目之功效。,第四节 举例,主含香豆素类成分七叶树苷（aesculin，秦皮甲素）及其苷元七叶树内酯（aescule

19、tin，秦皮乙素），并含白蜡树苷（fraxin）、白蜡树内酯（fraxetin）、紫丁香苷（syringin）等。,1定性分析,取秦皮粉末1g，加乙醇10ml，加热回流10min，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。另取秦皮甲素与秦皮乙素对照品，加乙醇制成每1ml各含5mg 的混合溶液，作为对照品溶液。 吸取上述两种溶液各3l，分别点于同一硅胶薄层板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 乙醇- 甲酸（3：4：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。,2定量分析,（1）薄层-分光光度法 对照品溶液的制备：精密称取经80干

20、燥至恒重的秦皮甲素对照品20mg，置10ml量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解，必要时可微温加热，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，即得。,标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液30、50、70、90与 110l，照薄层色谱法试验，沿硅胶薄层板的起始线分别点成 35cm的长条（据点样量的多少而定），以正丁醇- 氯仿- 甲苯- 甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm） 下检视定位，分别刮取对照品条斑置具塞锥形瓶中。同时刮取同一薄层板下端与条斑等面积的硅胶作为空白，置另一具塞锥形瓶中，各瓶均精密加入乙醇10ml，45水浴小心加热30min，放冷，滤过，取续滤液，照分光光度法，在3

21、36nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。,测定法：取秦皮粉末约1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。,照薄层色谱法试验，精密吸取供试品溶液50l，沿硅胶薄层板的起始线点成5cm的长条，另精密吸取对照品溶液5l，点于供试品条斑一侧间隔1.5cm处，作为对照。以正丁醇- 氯仿- 甲苯- 甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，刮取与对照品色谱中斑点相应位置上的供试品色谱中的条斑，照标准曲线的制备项下的方法，自“置具塞锥形瓶中”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中秦皮甲素的重量，计算，即得。 本品含秦皮甲素（C15H16O9）不得少于1.36%。,补骨脂: 为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的果实。具温肾助阳、纳气、止泻功效。,主含香豆素类成分补骨脂内酯（ps