动物细胞工程1 2010

1、1.植物组织培养的主要过程分为哪两步？ 2.不进行脱分化处理能否培养成完整的植物体？ 3.决定细胞脱分化、再分化的关键因素是什么？ 4.植物组织培养的固体培养基分为哪四部分？P36 5.植物组织培养所必需的环境条件是什么？,无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。,一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等,6.为什么植物组织培养过程必须无菌操作? 7.组织培养有什么应用价值？,用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差。因此为了防止微生物污染，要进行严格的无菌操作。,植物繁殖的新途径 快速繁殖植物 培育无病毒植株 培育转基

2、因植物（如抗虫棉等）制成人工种子 培育作物新品种 单倍体育种 突变体的利用 工厂化生产细胞产物,8.为什么利用植物的茎尖或根尖细胞可以培育出无 病毒植株？ 9.植物体细胞融合的第一步是什么？ 10.用什么方法可以去除细胞壁？ 11.去除细胞壁后的植物细胞又叫做什么？ 12.诱导原生质体融合的诱导剂叫什么？ 13.诱导原生质体融合的物理方法主要有哪些种？ 14.融合后的杂种细胞可以直接生长为杂种植株吗？ 15.植物体细胞融合的优点是什么？,植物体的茎尖和根尖分生区的细胞基本不含无病毒。,16.植物体细胞融合的不足或遗憾是什么？ 17.利用植物组织培养技术生产人参皂甙需要经过脱分化和再分化过程吗？

3、 18.利用植物组织培养技术繁殖名贵花卉，进行离体培养时为什么不要用该植株的花粉？,目前还无法让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性状。,只需要经过脱分化形成人参细胞即可产生人参皂甙，不需要再分化过程。,利用花粉组织培养育出的花卉是单倍体植物，生长发育不良。,动物细胞工程,2.2 动物细胞工程,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞工程常用的技术手段技术：,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,2、为什么要培养动物细胞？,一、动物细胞培养 1 、动物细胞培养的概念,许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞

4、分泌的蛋白质量是很少的，需要借助于大规模的动物细胞培养来实现。,动物细胞培养技术,动物细胞培养技术,3.动物细胞培养的过程,原代培养: 将动物组织消化后的初次培养。 传代培养: 对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10代细胞,50代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,动物细胞培养技术流程,为什么用胚胎组织或幼龄动物的组织细胞进行细胞培养,因为它们生命力旺盛，分裂能力强。（细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养）。,为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？,分散成

5、单个细胞、细胞群（团）后容易培养， 细胞容易获得营养物质，其代谢废物容易排出； 分散成单个细胞培养，容易完成细胞水平的工程技术操作 。,为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？,当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。,哪些细胞失去了接触抑制？,传代培养时，少数超过50代的细胞，由于遗传物质发生改变，可无限增殖，并失去了接触抑制肿瘤细胞。,无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境。,4、体外培养动物细胞需要物质和环境条件,无菌、无毒的环境 对培养液、培养用具进行无菌处理； 在培养液中加抗生素； 定期更换培养液。,充的营足养 葡萄糖、氨基酸

6、、促生长因子、无机盐、 微量元素、血浆或血清,温度和PH 36.50.5 ；PH = 7.27.4 气体环境O2和CO2 C02的主要作用是维持培养液的PH。 含 95% 空气加 5% CO2 混合气体,5.动物细胞培养应用： .大规模生产生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等； .检测有毒物质，判断某种物质的毒性； .培养基因工程中的受体细胞,植物组织培养和动物细胞培养的比较,二.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,1.动物细胞核移植概念：,2.体细胞核移植的过

7、程：,（难度高）,1958年到1962年，英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾 1970年John Gurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。,1984年，丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆出1只羊，这是第一例得到证实的通过核移植技术克隆出的哺乳动物。 1993年，美国的First用牛胚团细胞成功获得克隆牛。 1997年，中国学者孟励在美国用胚胎细胞克隆猴获得成功。,1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物

8、.,277次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,多莉羊诞生的意义： 多莉羊在技术上的突破之处在于供核细胞不是胚胎细胞，而是已分化的体细胞。这说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体。 克隆技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病、抢救濒危物种和保护生物多样性等方面有广阔的应用前景。,1998年，日本科学家Kato等用牛的输卵管细胞得到克隆牛。 1998年，美国人Yanagimachi领导的研究小组用克隆鼠的卵丘细胞核作供体，

9、获得了克隆再克隆小鼠。 2000年，美籍华裔学者杨向中领导的研究小组利用17岁公牛耳部皮肤的成纤维细胞成功获得克隆牛。 2003年5月28日第一匹克隆 马“普罗梅泰亚” 在意大利诞生(世界上首次由哺乳动 物生下它自己的克隆体，具有 母女、姐妹关系）。 技术：将母马表皮细胞的细胞核移植到去核卵细胞内，850个卵细胞,22个能够顺利完成细胞分裂过程,17只母马,4只怀孕,仅雌马“普罗梅泰亚”成功 （Nature，2003，8月7日）,2000年，美国科学家成功地克隆出首例长类灵动物一只恒河短尾猴“泰特拉（Tetra）”。与其它动物克隆不同的是，“泰特拉”未用细胞核移植技术，而是采用胚胎分解的方法，

10、将受精卵培育卵裂至8个细胞时将其分离，每2个细胞分为一部分，共分为4部分，并分别植入4个“代理母亲”子宫中，结果有一个“代理母亲”成功a生下了“泰特拉”，这意味着克隆人类已没有技术障碍。,核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？ 通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期的卵母细胞,诱导方法： 物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质绝大部分部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,为什么用于

11、核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，而且细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大

12、部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,3.体细胞核移植技术的应用前景：,1.加速家畜遗传改良的进程,2.保护濒危物种,3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植,4.了解胚胎发育和衰老过程； 追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,3、体细胞核移植技术存在的问题 P50,（1）成功率非常低 （2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题 成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,5.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30

13、.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。,（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？,可以。 卢辛达有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础。 克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,但是该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织的细

14、胞。 从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。 用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合。 用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。 核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内,6.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面： 克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用方面： 生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,处于减数第

15、二次分裂中期( M)的卵母细胞，是使用最多的卵细胞受体，原因是： 1.这个时期的卵母细胞胞质环境，完全支持外来的各种胚胎细胞、体细胞的遗传物质的发育、分化。 2.这个时期的卵母细胞更加利于进行体外的显微操作。,成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的M期和M期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此， M期卵母细胞中的MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可以影响供体和染色质的状态和复制,M期卵母细胞质的作用,M期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而M期卵母细胞中的细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育。因此，

16、尽管M期卵母细胞的MPF活性也高，但是不能用作受体卵母细胞。,.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成，必须由培养液提供。 血清激素有胰岛素、生长激素等以及多种生长因子，能促进细胞的生长、增殖和贴附。 因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清。,.幼龄与老龄的组织细胞相比较，分化程度低的与分化程度高的细胞比较，哪一种更易于培养？为什么？,细胞的衰老与动物机体的衰老有密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。 所以，幼年动物

17、的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更易于培养,.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。 因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了 要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,.如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间隙中含有是什么物质成份？,剪碎组织，再用胰蛋白酶处理。,胰蛋白酶可分解蛋白质。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,.细胞贴壁生长对培养容器有何要求？,培养皿或培养瓶的内表面要光滑、无毒、易于贴附。,动物细胞培养过程,胚胎或幼龄动物的组织器官（细胞来源）,细胞悬浮液,贴满瓶壁的细胞,无限细胞系,4050代细胞,1.什么是细胞分化？ 2.细胞分化后的细胞中遗传物质是否发生了改变？ 3.动物体内发生分化的细胞还能像受精卵一样再发育成一个完整个体吗？ 4.细胞分化有什么特点？,在生物个体发育过程中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程叫做细胞分化。,否。,否。一般来说，分化了的细胞将一