分离工程--第四章PPT.ppt

1、10.1反胶束溶液形成的条件和特点、优点：从结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂可重复使用、萃取率高、反萃取率高等突出优点。此外，反胶束萃取还可以解决外源蛋白降解的问题，即在非细胞环境中蛋白(胞内酶)的快速失活。此外，因为构成反胶束的表面活性剂通常具有溶解细胞的能力，所以它可以用于从整个细胞中直接提取蛋白质和酶。因此，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业发展前景的新途径。反胶束溶液的概念：反胶束溶液是一种透明的热力学稳定的体系。反胶团是表面活性剂分散在连续有机相中自发形成的纳米级聚集体，因此表面活性剂是反胶团形成的关键。10.1.1表面活性剂是由亲水和疏油的极性基团和亲油和疏水的

2、非极性基团组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，所有这些都可用于形成反胶束。常用的表面活性剂和相应的有机溶剂见表10.1。在反胶束萃取蛋白质的研究中，很容易得到阴离子表面活性剂AOT，其化学名称为琥珀酸钠-2-乙基己基磺酸钠，其结构式如图所示。其特点是双链，极性基团小，形成反胶团时无需添加助表面活性剂，形成的反胶团大，半径为170纳米，有利于大分子蛋白质的进入。常用的阳离子表面活性剂的名称和结构如下：(1)十六烷基甲基溴化铵(CTAB)十六烷基三甲胺/十六烷基三甲胺溴化物，(2) DDAB(双十二烷基甲基溴化铵)十二烷基二甲基溴化铵，(3)托马(三甲基氯化

3、铵)，当阳离子表面活性剂如CTAB溶解在有机溶剂中形成反胶束时，需要加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)，这与AOT不同。这是由于它们的结构差异。10.1.2临界胶束浓度(CMC)是形成胶束所需的最低表面活性剂浓度，是一个系统特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等有关。羧甲基纤维素的值可以通过测量各种物理性质(如表面张力、渗透压等)的变化来确定。)。由于实验方法不同，临界胶束浓度值往往难以完全一致，但突变点总是落在一个较窄的浓度范围内，因此用临界胶束浓度范围来表示更为方便。10.1.3胶束和反向放电束的形成，当表面活性剂溶解在水中时，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂将聚

4、集在水溶液中形成聚集体，其通常是水溶液中的胶束，称为正常胶束。结构示意图a。在胶束中，表面活性剂向外极性基团的方向排列，与内部的水和非极性基团接触，形成非极性核心，非极性物质可在其中溶解。如果表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，其浓度超过临界胶束浓度(CMC)，就会在有机溶剂中形成一种聚集体，称为反胶束，其结构如图B所示.在反胶束中，表面活性剂的非极性基团与非极性有机溶剂接触，而极性基团排列在里面形成po1ar核。这个极性核心有溶解极性物质的能力。极地核心溶解水后，形成一个“水池”。当含有反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触时，蛋白质和其他亲水物质可以通过螯合进入“池”。由于周围水层和极性基团的

5、保护，蛋白质的天然结构得以保持，不会导致失活。蛋白质溶解的过程和溶解后的情况如图所示。，b，a，c，反胶束的大小与溶剂和表面活性剂的种类和浓度、温度、离子强度等因素有关，一般为5-20 nm，其内池的直径d按下式计算，W0有机相中水与表面活性剂的摩尔比称为水含量，m和分别是水的相对分子质量和密度，以及表面活性剂分子在 surf界面的面积。在Avogadro常数下，双(2-乙基己基)琥珀酸钠常用作表面活性剂制备反胶束溶液，AOT在异辛烷中形成的反胶束直径(D)可由以下经验公式计算，d=0.3W0 0.24 (nm)，其中右侧第一项为反胶束的水核直径，第二项(2.4nm)为AOT的分子长度。通常，

6、反胶束的W0不超过40。因此，AOT形成的反胶束水核的直径一般不超过12纳米，可以容纳直径为5-10纳米的蛋白质。当蛋白质分子比反胶束直径大得多时(例如，当相对分子质量超过100-200 kD时)，很难溶解到反胶束中。当反胶束的含水量W0较低时，反胶束池中水的物理化学性质与普通水有很大不同。例如，以AOT为表面活性剂，当W0 16时，微水相中的水接近正常水，在反胶束中可以形成双电层。然而，即使当W0值很大时，水池中的水的物理和化学性质也不能与正常水完全相同，特别是在靠近表面活性剂亲水水头的区域。10.1.4反胶束的溶解。由于反胶团中有一个微池，它可以溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，并为生物分

7、子的生存提供一个亲水的微环境。因此，反胶束萃取可用于分离和纯化生物分子，如氨基酸、肽和蛋白质，尤其是蛋白质生物大分子。如图所示，对于反胶束溶解蛋白质的形式，已经提出了四种模型。其中，(a)是水壳模型，蛋白质位于池的中心，周围的水层将其与反胶束壁(表面活性剂)隔开；蛋白质分子表面有一个强疏水区，与有机相直接接触；蛋白质吸附在反胶束内壁上；(d)蛋白质的疏水区与表面活性剂的疏水尾部通过几个反胶团相互作用，并被几个小反胶团“溶解”。具有不同表面性质的蛋白质可以以不同的形式溶解在反胶束相中，但是水壳模型通常被亲水性蛋白质所接受。因为许多实验数据间接证明了水壳模型的正确性。例如：(1)反胶束中酶的结构和

8、活性与W0值密切相关，表明酶对其周围的水层非常敏感；(2)酶反应在反胶束中的动力学行为与在正常水相中的动力学行为相似，活性与pH值的关系也呈钟形。10.2反胶束溶解、反胶束萃取蛋白质的基本原理、10.2.1三元相图和蛋白质萃取。对于由水、表面活性剂和非极性有机溶剂组成的三元体系，有许多共存相，可用三元相图表示。该图是水- AOT -异辛烷体系相图的一个例子。从图中可以看出，只有底部的两相区可以用于蛋白质分离。另一相是反胶束溶液作为萃取剂。这些共存的两相通过连接线(图中的虚线)连接。该体系的物理化学性质非常适合萃取操作，界面张力在0.1-2 Mn/m范围内，密度差为10%-20%，反胶束溶液粘度

9、适中，约为1mPas。蛋白质进入反胶束溶液是一个协同过程，即宏观两相界面(有机相和水相)之间的表面活性剂层与相邻的蛋白质反应，然后在两相界面形成含有蛋白质的反胶束，反胶束扩散到有机相中，从而实现蛋白质的提取。提取过程和提取后的情况如图所示。改变水相条件(如酸碱度、离子种类及其强度等。)可以使蛋白质再次从有机相返回到水相。10.2.2蛋白质溶解于反胶束溶液的驱动力和分布特征，蛋白质溶解于反胶束溶液的驱动力主要包括表面活性剂和蛋白质之间的静电力和空间效应。(1)静电力：在反胶束萃取体系中，表面活性剂和蛋白质都是带电分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的驱动力。最直接的因素之一是酸碱度，它决定了蛋

10、白质带电基团的解离速率和蛋白质的净电荷。当酸碱度=时，蛋白质是电中性的。当ph 时，蛋白质带负电荷，即随着酸碱度的变化，提取的蛋白质的电荷的符号和数量是不同的。因此，如果静电作用是蛋白质增溶的主要驱动力，对于由阳离子表面活性剂形成的反胶束体系，只有当水溶液的酸碱度大于时才发生萃取，而当酸碱度小于时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取。对于阴离子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相反。此外，离子表面活性剂的抗衡离子并不都固定在反胶团表面。对于AOT反胶团，大约30%的抗衡离子被解离。同时，反胶束“水池”中的离子将与主水相中的离子交换，从而在萃取过程中与蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低蛋白质和表面

11、活性剂之间的静电力。另一种解释是离子强度(盐浓度)影响蛋白质和表面活性剂极性头之间的静电力，因为解离的反离子在表面活性剂极性头附近形成双电层，称为德拜屏蔽，从而缩短了静电引力的作用范围，抑制了蛋白质的提取，因此在提取过程中应尽可能避免后者的影响。(2)空间效应许多亲水性物质，如蛋白质、核酸和氨基酸，可以通过溶解到反胶束“池”中而溶解在非水溶剂中，但其物理性质(大小、形状等。)的反胶束“池”和其中水的活性可以通过W0的变化来调节，这将影响大分子如蛋白质的溶解或排斥，并达到选择性萃取的目的。10.2.2.2反胶束萃取中蛋白质的分布特征，蛋白质在两相之间的分布系数，反胶束浓度M和表面活性剂浓度Ssu

12、rf之间的关系，M=Ssurf/N (N是聚焦数)，10.2.3蛋白质反胶束萃取的动力学，在萃取过程中，蛋白质是相互不同的，在界面上形成含有蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中从界面扩散开。相反，含有蛋白质的反胶束从有机相扩散到界面；含有蛋白质的反胶束在界面处分解；蛋白质从界面扩散到水溶液的主体。蛋白质进入或离开反胶束相的传输通量可由下式计算：萃取过程，反萃取过程，10.3影响反胶束萃取蛋白质的主要因素，蛋白质萃取与反胶束中蛋白质表面电荷和表面电荷之间的静电相互作用以及反胶束的大小有关，因此任何能增强静电相互作用或导致形成较大反胶束的因素都有助于蛋白质萃取。下表显示了影响反胶束萃取蛋白

13、质的主要因素。只要系统地研究这些因素，确定最佳操作条件，就能获得合适的目标蛋白提取率，从而达到分离的目的10.3.1水相的酸碱度对萃取的影响水相的酸碱度决定蛋白质表面电荷的状态，从而影响萃取过程。只有当反胶束中的表面电荷，即表面活性剂的极性基团携带的电荷与蛋白质的表面电荷相反时，它们之间才会产生静电引力，蛋白质才能进入反胶束。因此，对于阳离子表面活性剂，溶液的酸碱度应高于蛋白质的等电点，并可进行反胶束萃取；对于阴离子表面活性剂，当pH PI时，萃取率几乎为零，当pH PI时，萃取率急剧增加，表明蛋白质的净电荷与表面活性剂的极性头相反，它们之间的静电作用有利于蛋白质的萃取。如果酸碱度很低，界面上

14、会产生白色絮状物，萃取率也会降低。这种情况可以被认为是蛋白质变性。水相的酸碱度对几种分子量相对较小的蛋白质提取的影响如图所示。对于不同相对分子质量的蛋白质，酸碱度对提取率的影响是不同的。当蛋白质的相对分子质量增加时，相转移只能通过增加pH-pI的绝对值来完成。例如，-糜蛋白酶(相对分子质量为25000)的提取率在酸碱度低于2-4的值时达到最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为68000)基本上在同一体系中。这种差异可以解释如下：含有大分子蛋白质的反胶团的大小远大于“空芯”反胶团的大小，因此在提取时需要消耗更多的能量，这只能通过强静电相互作用来补偿。通过调节酸碱度来增加蛋白质分子表面电荷的方法是增强

15、静电作用的一种方法。对于那些尺寸小于“空芯”反胶束中水体积的蛋白质，只要它们携带的净电荷与表面活性剂的净电荷相反，就可以进行萃取。如图所示，蛋白质的相对分子质量Mr和(pH-pI)的绝对值之间存在线性关系，这种关系也适用于由阴离子和阳离子表面活性剂形成的反胶束体系。10.3.2离子强度对萃取率的影响主要取决于离子对表面电荷的屏蔽作用：a .随着离子强度的增加，反胶束内表面的双电层变薄，削弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电引力，从而降低了蛋白质的溶解度；反胶束内表面的双电层变薄后，表面活性剂极性基团间的排斥力也减弱，反胶束变小，蛋白质无法进入；当离子强度增加时，离子向反胶束中“水池”的迁移增加，

16、取代其中蛋白质的趋势增加，因此蛋白质从反胶束中盐析出来；盐和蛋白质或表面活性剂之间的相互作用会改变溶解度，盐的浓度越高，其影响越大。例如，离子强度(KCl浓度)对核酶A、细胞色素C和溶菌酶提取的影响如图所示。从图中可以看出，几乎所有的蛋白质都是在较低的KCl浓度下提取的，当KCl浓度高于某一值时，提取率开始下降，直至几乎为零。当然，当不同的蛋白质开始下降时，KCl浓度是不同的。10.3.3表面活性剂类型：的影响已经提到，阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可以用来形成反胶束。从反胶团萃取蛋白质的机理出发，关键是选择有利于增强反胶团内表面电荷和蛋白质表面电荷之间静电相互作用的表面活性剂，并增加反胶团的尺寸。此外，还应考虑形成反胶束和使反胶束变大(由于蛋白质的进入)所需的能量。目前，AOT反胶束体系和其他研究中常用的体系存在许多缺点，如不能提取高分子量的蛋白质，经常在两相界面形成不溶性膜等。为了克服这些缺点10.3.4受表面活性剂浓度的影响，增加表面活性剂浓度可以增加反胶束的数量，从而增加蛋白质的溶解度。然而，当表面活性剂的浓度过高时，溶液中可能形成复杂的聚集体，这将增加剥离过程的难