第八章 细胞骨架蛋白

1、,第八章 细胞骨架蛋白 第一节 概论 第二节 中间丝蛋白质 第三节 肌动蛋白微丝系统 第四节 微管系统蛋白质,细胞骨架蛋白：细胞质中由蛋白丝组成的非膜相 结构系统的蛋白质称为细胞骨架蛋白. 细胞骨架系统：微丝、微管和中间丝组成。 三个系统分别由许多性质不同的蛋白质所构 成，但它们的三维结构、装配和解聚、以及功能 却有明显的共同之处。,微管、微丝和中间丝蛋白免疫荧光图片 大鼠肾细胞系（PtK-1）；绿色荧光（蛋白质）：红色荧光（细胞核DNA）,广义的细胞骨架还包括 核骨架（nucleoskeleton）、核纤层（nuclear lamina）细胞外基质（extracellular matrix）

2、 三者形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。,构成细胞骨架的主要蛋白质： 肌动蛋白（肌动蛋白相关蛋白） 微管蛋白（微管相关蛋白） 中丝间蛋白（各种中间丝相关蛋白） 本章主要介绍它们的分子特征，功能，纤丝的形成与解聚的调控。,细胞骨架的功能： 维持细胞一定的形状； 参与动物细胞的运动（如巨噬细胞、白细胞通过 阿米巴样的作用在组织中迁移与骨架的聚合 和解聚相关。细胞分裂、收缩、细胞的纤毛 活动都与细胞骨架有关。) 细胞内部成分的转运（如神经轴突的生长，达 500cm或更长。细胞分裂时，染色质向细胞的 转移）,细胞骨架的主要功能,（来自 G. Karp 2002）,第一节 概论 一、细胞

3、骨架的概念 二、纤丝系统的功能 三、相关蛋白的功能,一、细胞骨架的概念 当细胞膜被非离子型表面活性剂 破坏时，大部分胞质流失，这一部 分称胞液（cytosol）。 细胞骨架（cytoskeleton）：细胞流失胞液后的不溶残余部分,仍保持细胞外形,具有决定细胞形态作用的纤维网络。 细胞骨架相关蛋白：在肌动蛋白微丝、中间丝、微管纤丝纯化时被共同纯化的蛋白质，称为相关蛋白（associated proteins）。,二、纤丝系统的功能 纤丝的功能有很多共同之处，如： 形成网络决定细胞的形状； 加固细胞成分； 纤维收缩（反平行纤丝滑行）如肌肉收缩； 杆体收缩（平行纤丝滑行）,如纤毛和鞭毛活动； 导向

4、转运的轨道，如神经细胞中沿微管转运物质或颗粒； 沿纤丝传导信息。,三、相关蛋白的功能 相关蛋白通过以下方式控制纤丝聚合： 与单体结合,防止单体聚合； 启动聚合过程； 当聚合达到一定长度后封闭纤丝的尾端（加帽）； 通过等量蛋白结合促进纤丝延长； 促进解聚，包括切短； 通过酶学作用修饰聚合体的亚单位； 结合在纤丝的周边而加固纤丝； 将纤丝交联成束或网络； 有时形成纤丝突起，与其他类型纤丝、膜系统相互作用，通过结构间的张力，形成交联桥，产生运动。,第二节 中 间 丝 一、中间丝的结构 二、组成中间丝的蛋白质及其分类 三、中间丝相关蛋白 四、中间丝的功能,一、中间丝的结构 各种中间丝（IF）结构非常相

5、似，直径10nm,处于微管和微丝之间，故名中间丝（或10nm纤丝）。,几种中间纤维的模式图,中间丝,巢蛋白 (Nestin,一种中间丝蛋白，绿) 神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP,红）,IF的蛋白质分子量和等电点不同，分成几类： 细胞角蛋白（cytokeratin） 结蛋白（desmin） 波形蛋白（vimentin） 神经丝蛋白（neurofilament protein） 胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP） 核纤层蛋白（lamin）等。 有些细胞IF很多，如上皮细胞(皮肤抗磨擦和脱水)，有的细胞完全没有。,IF蛋白的分子特征 分子中

6、有一个中间结构域，其中93%氨基酸可形成螺旋，也称杆状结构域（rod domain），N端有Mr15kD头部，C端为Mr5-10kD尾部。 杆状结构域具有7氨基酸重复序列，它们形成卷曲螺旋（coiled coil），杆状结构域长度比较恒定（约310个氨基酸残基） 。 两端为非螺旋区，尾部耐受胰凝乳蛋白酶的水解，头部有许多折叠结构，可被胰凝乳蛋白酶水解。,中间丝的结构 中间丝结构装配和排列尚有争议。,二、中间丝的蛋白质及其分类 据氨基酸序列、基因结构、组装特性及组织特异性表达模式 型（酸性）角蛋白； 型（中性和碱性）角蛋白； 型，如波形蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白及外周蛋白； 型，包括神经丝蛋

7、白和-介连蛋白； 型，包括核纤层蛋白A及其剪切体核纤层蛋白C，核纤层蛋白B1和B2； 型，包括巢蛋白、微管卷曲蛋白和desmuslin。 植物、真核微生物、非脊椎动物细胞也有IF，结构基本相 似，了解还不多。,（一）角蛋白（IF多肽型和型的异多聚体） 角蛋白家族是IF蛋白中存在最多的一类。 据硫含量的多少（即二硫键）将角蛋白分为硬角蛋白和软角蛋白，占上皮细胞胞质蛋白的80%。角蛋白种类很多，皮肤细胞至少30种。 角蛋白分子通常形成异多聚体，即由一个型（酸性的）二 聚体和一个型（中性/碱性）二聚体组成异四聚体。 角蛋白有形成束的特性。最易观察到的是硬角蛋白，分布在 毛发、甲、角和蹄等。这些组织的

8、形成是由于整个细胞的固化， 而不是简单的将硬角蛋白分泌到表面。,（二）同多聚体型IF 在各种非表皮细胞内形成中间丝，其氨基酸同源性很高。包括以下几种： 1.波形蛋白 2.结蛋白 3.胶质原纤维酸性蛋白（GFAP） 4.外周蛋白（peripherin）,1. 波形蛋白（vimentin） 间质细胞（如成纤维细胞）的主要结构蛋白，C端尾部特异地结合于细胞核外膜，N端头部结合细胞膜，故在细胞核和细胞膜之间形成联接。 波形蛋白有蛋白激酶C和蛋白激酶A磷化位点，通过 磷酸化与去磷酸化，可改变不溶 的中间丝网络。,波形蛋白/胆碱乙酰基转移酶,2. 结蛋白 结蛋白（desmin）是肌细胞的主要IF蛋白，在平

9、滑肌中含量特别丰富。 在平滑肌细胞中，结蛋白中间丝形成一个相互连接的网络，连接胞质的致密体（dense bodies，相当于横纹肌的Z-盘）和细胞膜的致密体斑块（dense plaques）。 在横纹肌中，结蛋白靠近两个细胞 的细胞膜连接 ，也存在于Z-盘。,心肌结蛋白染色,3. 胶质原纤维酸性蛋白（GFAP） 胶质细胞专一的中间丝，具有支持神经 细胞的作用。GFAP可作为免疫标记。 4.外周蛋白（peripherin） 存在于外周神经系统和某些中枢神经系统的神经细胞。它可与型IF多肽聚集，但在性质上更类似于结蛋白和波形蛋白。,皮肤过度松弛症(遗传缺陷) 胶原纤维不能正确地装配,（三）神经丝蛋

10、白 神经细胞的中间丝称为神经丝（neurofilaments, NFs），由神经丝蛋白组成。 神经丝蛋白:异多聚体，三种亚基：NF-轻链（NF-L）、NF-中间链（NF-M）和NF-重链（NF-H）。 单一的NF-L可聚合成丝状体，而NF-M和NF-H不能聚合；分子中多个磷酸化位点，带多个负电荷。 C末端：富含谷氨酸；用蛋白酶处理后，残余的10nm纤丝与其他类型的中间丝差异很小。,（四）核纤层蛋白 核膜内表面的一层网络状纤维蛋 白质，称核纤层（nuclear lamina） 脊椎动物细胞中有三种类型的核纤层蛋白(A,B,C), A和C:是不同的剪接体；B:由另一基因编码, 经翻译后修饰,在C端

11、添加疏水的异丙基, 以帮助核纤层蛋白B插入到核膜的内脂层。,核纤层蛋白的功能： 1.保持核的形态：是核被膜的支架。 用高盐溶液、非离子去污剂和核酸酶去除核物质，剩 余的核纤层仍能维持核的轮廓。使胞质骨架和核骨架形 成网络结构。 2.参与染色质和核的组装：核纤层在细胞分裂时呈周期性变化. 间期核中：为染色质提供核 周边锚定位点。 前期结束时：核纤肽磷酸化， 核膜解体。 分裂末期：核纤肽去磷酸化、 重新组装，介导核膜重建。,四、中间丝的功能 了解甚少，主要功能：加强细胞韧性、抗张力破坏。 使细胞器固定于细胞质，如角蛋白K14剔除小鼠线粒体成簇聚集。 缺少IF的成纤维细胞，细胞核形态失常。,第三节

12、肌动蛋白微丝系统 主要成分是肌动蛋白，肌动蛋白是含量最多的细胞骨架蛋白；物种间氨基酸高度保守，单体聚合成微丝后结构也几乎不变。 但是不同单体产生的微丝在稳定性和与其他蛋白质（如肌球蛋白）相互作用方面有细微的差别。,一、肌动蛋白单体 肌动蛋白是微丝的结构蛋白,由单体和多聚体两种形式存在，单体也称球状肌动蛋白(G-actin), Mr:43kD，由两个结构域组成，结构域之间为短的柔性连接肽（ATP结合部位）。 单体可与其他分子作用,包括:肌球蛋白（myosin，）、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌动蛋白抑制蛋白（profilin）和肌动蛋白蚕食蛋白（depactin）等。,二、肌动蛋白微丝

13、的聚合 肌动蛋白多聚体形成肌动蛋白丝, 也称纤维状肌动蛋白(F-actin)。肌动蛋白纤维由两条线性排列的肌动蛋白链形成螺旋，状如双线捻成的绳子。,肌动蛋白微丝的聚合过程,肌动蛋白纤维装配过程: 成核、生长、动态平衡三个连续的过程。,肌动蛋白单体有极性, 装配呈头尾相接, 故微丝(MF)有正极与负极。 体外实验：MF正极与负极都能生长，正极生长快，负极慢； 去装配时，负极比正极快。 由于G-actin在正极端装配，负极去装配。 在体内, 有些微丝是永久性的结构, 有些微丝是暂时性的结构。,原子力显微镜(atomic force microscope , AFM)图,在生长、发育的信号调控中具有

14、重要的调控作用.,三、肌动蛋白相关蛋白 肌动蛋白+肌动蛋白相关蛋白（actin-associated proteins, AAP）性质发生改变. 已分离到许多AAP，多数细胞含有10多种APP， AAP与肌动蛋白的互作是竞争性的。,（一）钙结合蛋白 许多肌动蛋白相关蛋白（AAP）与肌动蛋白结合受Ca2+控制,分子中有专一的Ca2+结合部位。 如小白蛋白（parvalvumin）,是一种钙结合蛋白,分子中具有EF手结构,在钙浓度为10-6mol/L时能与钙结合(胞内外Ca2+浓度相差1万倍左右),许多钙结合蛋白都有类似结构。,（二）控制聚合的蛋白质 这类蛋白质能够通过加帽（capping）、单体

15、结合（monomer-sequestering）和解聚(depolymerization )来控制肌动蛋白的聚合，有以下几类：,1 .加帽蛋白（capping protein） 可选择性阻断F-肌动蛋白微丝的一端.如倒刺端加帽蛋白会造成微丝缩短，而尖端加帽蛋白会造成微丝的延长。 这种作用使细胞骨架重排，对那些高运动性细胞特别重要。 尖端加帽蛋白:辅肌动蛋白（-actinin）,Mr类似肌动蛋白。 倒刺端加帽蛋白:简称HAI，Mr约20kD，可能是Mr为150kD-200kD 蛋白质的水解产物。,肌动蛋白丝两端生长 用加帽蛋白封住负端, 微丝继续快速加长, 假如用加帽蛋白封住正端, F-肌动蛋白

16、加长的速率非常慢，表明正端是生长端。,2 .F-肌动蛋白切割蛋白 钙结合蛋白，但无EF手结构，故不属钙调蛋白类。 常见有胶溶蛋白（gelsolin），该蛋白既具有倒刺端加帽蛋白活性，又具有钙激活的微丝切割活性。 存在于细胞中，也可分泌入血（有一段分泌前导肽）。血中胶溶蛋白具有清除死亡细胞释放入血的F-肌动蛋白功能。,肠绒毛蛋白（villin）：具Ca2+依赖性切割活性； 片段化蛋白（fragmin）：参与肌动蛋白的切割调节； 肌割蛋白（severin）：具加帽和切割活性； 胶溶蛋白及相关切割蛋白也有肌动蛋白聚合的成核作用。当将其加入G-肌动蛋白溶液时，G-肌动蛋白的聚合反应加强。,3肌动蛋白单

17、体结合蛋白 能与G-肌动蛋白单体形成1:1复合物，阻止肌动蛋白聚合。 如肌动蛋白抑制蛋白（profilin）是一种小分子碱性多肽（Mr12kD-15kD），首先从胸腺获得，血小板中含量最高；酵母中也发现一些大小和性质相似的蛋白质。 体外实验发现，它能降低G-肌动蛋白单体聚合反应。敲除其基因的酵母不能成活(致死性)。,4F-肌动蛋白解聚蛋白 小分子肌动蛋白，具有胶溶蛋白和肌动蛋白抑制蛋白的双重活性，能切割F-肌动蛋白并结合G-肌动蛋白单体，这些蛋白被称为肌动蛋白解聚因子。 如人类大脑分离的cofilin（磷蛋白，去磷酸化后易位到细胞核，Cofilin在细胞的运动中具有广泛而重要的作用 ），肾脏分

18、离的destrin，从星鱼卵细胞分离的肌动蛋白蚕食蛋白（depactin）和从星鱼分离的载肌动蛋白（actophorin）均属于这一类。,（三）产生力的蛋白质（分子马达） 主要为肌球蛋白类，可组成粗丝，具ATP酶活。 肌球蛋白超家族分18类，分为传统肌球蛋白和非传统肌球蛋白，只有肌球蛋白为传统肌球蛋白，其余为非传统肌球蛋白。 这类蛋白在肌肉中含量非常丰富，易聚合和解聚，故很容易纯化。常见： 肌球蛋白:（不加入粗丝），使膜性小囊泡沿着肌动蛋白束 运动；从阿米巴中曾分离到两种不同的肌球蛋白，即肌 球蛋白IA和肌球蛋白IB。 肌球蛋白:(聚合并加入粗丝）,与肌肉收缩相关。,（四）交联和促进成束的蛋白

19、 1、血影蛋白及相关蛋白 血影蛋白（spectrin）首先从红细胞获得，故得名。从脑获得的称胞影蛋白（fodrin）。 红细胞膜骨架的主要成份，分子含a链和链，Mr.均约为230kD。两个亚基反向平行排列, 扭曲成麻花状，形成异二聚体, 两个异二聚体头-头连接成200nm长的四聚体。再进一步形成“连接复合物”。,连接复合物的形成,2.辅肌动蛋白 辅肌动蛋白（-actinin）是保持肌节（sarcomeres）的重要元件。 该蛋白是肌动蛋白成束的主要交联蛋白之一，使肌动蛋白束次序排列。在非肌细胞中则与F-肌动蛋白的作用大致相同（有血影蛋白样结构域）。 辅肌动蛋白通过与整连蛋白、钙粘蛋白等作用,稳

20、定细胞粘附、调节细胞形状及细胞运动等.,3、凝胶因子 有肌动蛋白结合位点，将肌动蛋白丝交织成网，使之形成疏松而高度黏稠的胶体。 如肌动蛋白结合蛋白（ABP）和细丝蛋白（filamin）。都是双极同二聚体，长杆状分子，有相当的弯曲性，与肌动蛋白结合时对钙不敏感。,4、肌肉收缩相关的蛋白质,（1）肌动蛋白 肌动蛋白纤维由两条肌动蛋白链形成的螺旋，如双线捻成的绳子。肌动蛋白单体为球形分子，称球形肌动蛋白(G-actin)，其多聚体称纤维形肌动蛋白F-actin 。,（2）肌球蛋白（myosin） 如前述，属于马达蛋白，利用ATP产能，最初发现于肌肉组织(myosin II)，后发现多种非肌细胞myo

21、sin。目前已发现18种类型。 Myosin II是构成肌纤维的主要成分之一。由两条重链和两条轻链组成，并两个分子尾部相连，缔合形成粗丝双极性结构，球形的头部具有ATP酶活性,肌球蛋白缔合形成 粗丝双极性结构,由2条轻链和2条重链 组成的肌球蛋白分子,肌小节模式图,(肌联蛋白,titin）,肌小节中粗丝在细丝间滑动模式,（3）原肌球蛋白（tropomyosin） 原肌球蛋白（tropomyosin.Tm）分子量64KD，由两条平行的 多肽链扭成螺旋，每个Tm分子长 41nm，具有7个肌动蛋白结合位 点，呈长杆状，结合于肌动蛋白 双螺旋的沟中。 作用:是加强和稳定肌动蛋白丝， 抑制肌动蛋白与肌球

22、蛋白结合。 细丝:F肌动蛋白、原肌球蛋白和 肌钙蛋白组成。,（4）肌钙蛋白（troponin） 肌钙蛋白（troponin,Tn），Mr.80KD，三个亚基：肌钙蛋白C（TnC）特异地与钙结合;肌钙蛋白T（TnT）与原肌球蛋白有高度亲和力，肌钙蛋白I（TnI）抑制肌球蛋白的ATP酶活性，细丝中每隔40nm就有一个肌钙蛋白复合体。 当肌质内钙离子浓度升高时，Ca2与TnC结合，构象改变，TnT牵动原肌球蛋白，使其与F-肌动蛋白脱离接触，从而暴露肌动蛋白单体上的肌球蛋白结合位点。促使肌球蛋白与肌动蛋白相互作用形成横桥，引起肌肉引缩。,肌肉收缩(摆动联桥模型，swinging cross-bridg

23、e model),肌细胞膜兴奋传导到终池终池Ca2+释放肌浆Ca2+浓度增高Ca2+与肌钙蛋白结 合原肌球蛋白变构肌球蛋白横桥头与肌动蛋白结合横桥头ATP酶激活分解ATP 横桥扭动细丝向粗肌丝滑行肌小节缩短。,5钙调结合蛋白（caldesmon） 是与肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和钙调蛋白互作的平滑肌和非肌调节蛋白。平滑肌钙调结合蛋白C-末端具有钙调蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白结合区，N-末端具有肌球蛋白结合区。 通过二硫键形成寡聚体，分子的两端可与F-肌动蛋白结合使其成束,与肌动蛋白的作用可被原肌球蛋白所增强。1个钙调结合蛋白可结合14个肌动蛋白单体。,（五）连接细胞膜与F-肌动蛋白的蛋白质

24、 如粘着斑蛋白（vinculin）、踝蛋白（talin）、锚蛋白（ankyrin）、膜联蛋白（annexins）、膜桥蛋白（ponticulin）等。可与F-肌动蛋白结合并将其连接到细胞膜。,四、肌动蛋白微丝的功能 细胞结构与细胞运动。 细胞分裂，特别是后期，需肌动蛋白锚定于细胞膜。 近来发现，细胞骨架与细胞凋亡有关。 Lanerolle和同事发现,HL-60细胞株凋亡时，F-肌 动蛋白先短暂聚合，但后期即发生解聚，肌动蛋白微丝 形态上发生剧烈的变化。,细胞器的转运,第四节 微管系统 几乎所有真核细胞都含微管,大多数微管是单一圆筒状,少数微管呈双圆筒状（如鞭毛）,囊状体（busal bodie

25、s）和中心粒中的微管是三圆筒状。 目前认为微管中（但不是全部）含有高度保守的微管蛋白。 微管蛋白Mr在55kD左右,微管蛋白（小）,微管蛋白（大）,形成二聚体。,向细胞中央辐射的微管,一、微管的结构 多数天然微管由13条原丝组成，少数微管有7、9、12或15条原丝。 纯化的微管蛋白在体外重新聚合，得到的微管大多数含13条原丝，但也会出现一定比例的14和15条原丝微管，表明在蛋白纯化时丢失了一些细胞成分，使原丝数目发生了变化。,微管纤维 微管是由13条原丝（protofilament）构成的中空管状结构。,二、微管蛋白 微管蛋白的和两种亚基均可结合GTP， 但GTP是亚基的固有组分，不发生水解或

26、交换；亚基的GTP可发生水解，结合的GDP可交换为GTP，可见亚基也是一种G蛋白。,多烯紫杉醇,三、微管相关蛋白 微管相关蛋白（microtubule associated proteins，MAPs）：至少含一个结合微管的结构域和一个向外突出的结构域。 突出部位伸到微管外与其它细胞组分（如微管束、中间纤维、质膜等）结合。,MAP的主要功能： 促进微管聚集成束； 增加微管稳定性或强度； 促进微管组装。 主要有两类微管相关蛋白： MAP:热敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神经细胞 。 MAP:热稳定，包括MAP2a、b、c，MAP4和tau蛋白。MAP2有多 个磷酸化位点，磷酸化后与微管的亲和力下降，含量减少 会影响树突的生长。,四、微管的组装 微管组织中心（microtubule organizing center MTOCs）是微管进行组装的区域。 着丝粒、成膜体、中心体、基体均