免疫检测技术的基本原理演示.ppt

1、1,第三节免疫检测技术的基本原理,?,抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原,检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未,知的抗原,.,?,将免疫反应与现代测试技术结合,?,超微量的检测,2,3,免疫学检测技术的优点,?,高度的灵敏性,?,高度的特异性,4,免疫分析技术的应用,?,常用的诊断技术,血凝试验,酶联免疫吸附试验,胶体金免疫技术,放射免疫分析技术,5,凝集试验,?,概念：颗粒性抗原,(,细菌、红细胞等,),与相应抗,体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，,称为凝集反应。,1.,直接凝集反应,?,抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳,性结果。,?,玻片直接凝集法：定性试验,?,试管直接凝集

2、法：半定量试验,6,试管法半定量试验,+,玻片直接凝集试验,1,/,2,1,/,4,1,/,8,1,/,1,6,1,/,3,2,1,/,6,4,1,/,1,2,8,1,/,2,5,6,1,/,5,1,2,7,2.,间接凝集法,?,先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上,(,如,RBC,乳胶颗粒,),，再与相应抗体或抗,原反应，出现凝集为阳性结果。,?,临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试,验等。,+,待检样品,抗原吸附血球,或乳胶颗粒,反应凝集物,8,3.,间接凝集抑制试验,?,先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知,抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。,例：乳胶凝集抑制试验检测,HC

3、G (,妊娠诊断,),步骤,1,：将已知抗体,与待检标本混匀,步,骤,2,：,加,入,抗,原,吸附的乳胶颗粒混,匀,抗,原,吸,附,乳胶颗粒,结果判断：,不,凝,集,为,阳性结果,已知抗体,待检标本,9,凝集反应,10,2.,沉淀反应,概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出,现沉淀物称沉淀反应。,类型：,单向免疫扩散,免疫比浊法,双向免疫扩散,对流免疫电泳,11,单向琼脂扩散试验,12,双向琼脂扩散试验,13,对流免疫电泳,14,测吸光度,计算抗原,或抗体的,含量,抗体,抗原,免疫复合物的,浓度与透射光,的衰减呈正相,关,免疫比浊法原理,15,3.,中和反应,如抗“,O”,试验,4.,免疫标记技术

4、,概念：用荧光素、酶、同位素等,标记抗体或抗原用以测定相应抗原或,抗体的技术称为免疫标记技术。常用,方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、,放射免疫检测技术等。,特点：敏感、特异、快速，能定,性、定量、定位。,16,免疫标记技术,?,酶免疫标记技术,?,荧光免疫分析技术,?,放射免疫分析技术,?,免疫金标记技术,17,酶联免疫吸附试验,?,1971,年瑞典学者,Engvail,和,Perlmann,荷兰学者,Van Weerman,和,Schuurs,分,别报道将免疫技术发展为检测体液中微量,物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸,附测定法,(enzyme-linked,immunosorbent a

5、ssay , ELISA),18,酶及其底物,酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原,在交联剂作用下联结的产物。是,ELISA,成败,的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的,免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物,放大作用，但不同的酶选用不同的底物,，,将得到不同的颜色反应,.,19,酶,底,物,显色,反应,测定波长,辣根过氧化物酶,邻苯二胺,四甲替联苯胺,氨基水杨酸,邻联苯甲胺,2,2,-,连胺基,-2(3-,乙基,-,并噻,唑啉磺酸,-6),铵盐,橘红色,黄色,棕色,兰色,蓝绿色,492,460,449,425,642,碱性磷酸酯酶,4-,硝基酚磷酸盐,(PNP),萘酚,-AS-Mx,磷酸盐,+,重

6、氮盐,黄色,红色,400,500,葡萄糖氧化酶,ABTS+HRP+,葡萄糖,葡萄糖,+,甲硫酚嗪,+,噻唑兰,黄色,深蓝色,405,420,-,半乳糖,苷酶,甲基伞酮基半乳糖苷,(4MuG),硝基酚半乳糖苷,(ONPG),荧光,黄色,360,450,420,20,?,2,、标记方法,?,戊二醛交联法,?,过碘酸盐氧化法,21,戊二醛交联法,(,一步法）,抗体,-NH,2,+ COH-,（,CH,2,）,3,-COH + NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,抗

7、体,酶,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,22,戊二醛交联法（二步法）,COH-,（,CH,2,）,3,-COH + NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,+ CHO-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,23,过碘酸盐氧化法,O,O,O,O,O,O,NaIO,4,O,O,OH,O,O,OH,OH,+ NH,2,抗体,O,O,O,N,N,抗体,抗体,H,2,O,N,抗体,NaBH,4,Schiff,碱,酶,-,五炭糖环,24,标记免疫物的分离与鉴定,1,、分离,

8、目的：去除游离酶,方法：盐析、柱层析,2,、鉴定,抗体活性,酶活性,标记物纯度,25,ELISA,的种类和变化,（一）双抗体夹心法,（二）间接法,（三）竞争法,（四）双位点一步法,（五）捕获法测,IgM,抗体,（六）应用亲和素和生物素的,ELISA,26,27,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,28,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相,载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的,抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体,表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成,固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他,未结合的物质,加酶标抗体生成,抗体,待

9、测抗原,酶标记抗体,的复合物,彻底洗涤,未结合的,酶标抗体,加底物进行,酶催化反应,根据颜色反应的,程度进行该抗原,的定性或定量测定,29,间接法是检,测抗体最常用的方,法，其原理为利用,酶标记的抗抗体以,检测已与固相结合,的受检,抗体,，故称,为间接法。,（二）间接法,30,酶联免疫吸附试验,(ELISA-,间接法,),31,包被固相载体,:,用已知抗原包被,固相载体,加待检标本,:,使相应抗体与固相抗原结合,洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体,:,与固相载体上抗原抗体,复合物结合；洗涤，除去,未结合的酶标抗抗体,加底物,显色,根据颜色反应的程度进行,该抗原的定性或定量测定,32,（三）竞争

10、法,此法可用于抗原和半抗原的定,量测定，也可用于测定抗体,。,33,用已知特异性,抗体包被,固相载体,测定管加待测抗原和,一定量的酶标抗原使二者与,固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原,与固相抗体直接结合,分别洗涤,除去未结合,的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，,根据对照管与测定管吸光度值之比，,计算标本中待测抗原含量,34,对照管由于只加酶标抗原，与固,相抗体充分结合，故分解底物显色深；,测定管的显色程度则随待测抗原和酶,标抗原与固相抗体竞争结合的结果而,异。如待测抗原量多，竞争性地抑制,酶标抗原与固相抗体结合，使固相上,结合的酶标抗原量减少。因此，加入,底物后显色反应较弱。

11、,35,饲料中盐酸克伦特罗的测定,饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，,简曲霉毒素,）,饲料中有害微生物的快速筛检,（如沙门氏,菌,）,甲胺磷残留分析,甲基对硫磷残留分析,呋喃丹残留分析,ELISA,在饲料安全检测中的应用,ELISA,用于农药残留的检测,36,河豚毒素,植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类,例如杀暝松（,FN,）、,甲氟磷酸异已酶（,SOMAN,）、,草不绿（,Alachor,）、,西维因（,Carbaryl,）、,多菌灵及克菌丹（,Captan,）等。,农药的检测,：,37,食源性病原菌检测试剂盒,大肠杆菌检测,沙门氏菌检测,单增李斯特菌,

12、金黄色葡萄球菌,38,转基因成份的检测：如转基因玉米中中的,cry9e,蛋白,转基因大豆中的,CP4 EPSPS,蛋白质,肉制品的掺假检测：,以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋,A,抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测,14,种,畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在,掺假率为,1%,时即可检出,食品其他检测,：,39,荧光抗体技术的原理与方法,?,用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗,原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的,IC,可,散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和,定位。,?,常用的荧光素,?,异硫氰酸荧光素,(FITC),、藻红蛋白,(PE),等。,

13、?,常用的方法,?,直接荧光法,?,间接荧光法,40,免疫荧光技术,41,免疫荧光技术,直接法,Ag,荧光素标记的,特异性抗体,组织切片,42,免疫荧光技术,间接法,Ag,荧光素标记,的抗抗体,组织切片,待测抗体,43,免疫荧光技术,44,荧光显微镜,45,荧光显微镜使用原理,激发滤片（,BG,）,吸收滤片（,OG,）,标本,FITC,吸收光峰值：,490-495nm FITC,发射光峰值：,520-530nm,BG,：,325-500 OG,：,410-650,46,免疫金标记技术,?,免疫金标记技术,(Immunogold labelling,techique),主要利用了金颗粒具有高电子

14、密度,的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑,褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚,集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定,性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通,过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色,（,immunogold silver staining,，,IGSS,）,。,47,一、胶体金制备,胶体金,（,colloidal gold,）,的制备一般采用,还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗,坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金,溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金,原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶,（,gold,solution,）,。,48,胶体金

15、的制备及特性,胶体金粒径,1%,柠檬酸钠加入,量,胶体金特性,（,nm),（,ml)*,呈色,lmax(n,m),16,2.00,橙色,518,24.5,1.50,橙红色,522,41,1.00,红色,525,71.5,0.70,紫色,535,*,还原,100 ml0.01%HAuCl4,所需量,49,胶,体,金,（,Colloidal Gold,）,1560 nm,优,质,劣,质,50,胶体金结合物,（,Conjugate,）,51,GIFA,的组成及操作,（图示）,快速检测技术简介,一、免疫渗滤测定,(IFA),52,斑点渗漏法,?,其原理与层析法相类同，中心圆点为一株,单抗，边上小点为抗

16、鼠二抗。先将待测样,品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆,点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株,单抗，若有抗原则形成金,-Ab-,Ag?,薄膜的,红色斑点，而边上是金,-Ab-,Ab2?,薄膜的质,控点，是为金标二步法。,53,IFA,双抗体夹心法测抗原,A,B,54,IFA,结果判断,阳性,InstantChek,?,HIV 1+2,的结果判断,(,图,像,),阴性,测定无效,55,二、免疫层析测定（,ICA,）,L,A,T,E,R,A,L,F,L,O,W,T,E,S,T,S,T,R,IP,O,F,V,E,D,A,L,A,B,3,0,56,层析法,?,将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维,纸

17、上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，,并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形,成,Ag-Ab-,金复合物，当上行至中段醋酸纤,维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被,固定下来，显示阳性结果。其上方还有一,条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即,被固定下来，作为金标单抗质控的提示。,此种方法称金标一步法。,57,兔抗鼠,IgG,鼠抗,HCG,单抗,金标鼠抗,HCG,单抗,尿液浸湿标志线,手持端,斑点金免疫层析试验（一）,58,斑点金免疫层析试验（二）,尿样,阳性,弱阳性,阴性,无效,质控线,测试线,59,ICA,双抗体夹心法测抗原,60,ICA-,竞争法测抗原,免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图,61

18、,ICA,竟争法结果观察,阴性,阳性,无效,62,ICA,间接法测抗体,63,ICA,结果观察,阳性,阴性,无效,64,IFA,与,ICA,的比较,IFA,ICA,试剂形式,渗滤装置及附,加试剂,试剂条,试剂保存,4,8 6,个月,室温一年,操作步骤,3,5,1,观察时间,3 min,3,20 min,阳性反应颜色,浓度,操作结束颜色,不变,颜色逐渐加深,65,IFA,穿流（,FLOW THROUGH,）,ICA,横流（,LATERAL FLOW,）,66,?,1,、,罗立新,缪珑,潘力,等,.,快速检测产单核,李斯特菌免疫胶体金层析法的研究,J.,中国卫,生检验杂志, 2006, 16(2)

19、: 154-156.,?,2,、,赖卫华,熊勇华,陈高明,等,.,应用胶体金,试纸条快速检测赭曲霉毒素,A,的研究,J.,食品,科学, 2005, 26(5): 204-207.,67,?,3,、,谌志强,段惠莉,王新为,等,.,大肠埃希,菌,O157:H7,的胶体金免疫渗滤法检测,J.,中国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706.,?,4,、,谢昭聪,宋志强,吕敬章,等,.,应用胶体,金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研,究,J.,中国国境卫生检疫杂志, 2005,28(3): 163-165.,68,?,5,、,王中民,李君文,王新为,等,.,免疫金渗滤,试验检测食品中沙门氏

20、菌的研究,J.,微生物,学免疫学进展, 2001, 29(4): 45-47.,6,、刘永德,汪毅,陈禹雷,免疫金探针快速检,测禽流感病毒研究,J.,上海交通大学学报,:,农,业科学版, 2005, 23(3): 321-324.,69,斑点金免疫渗滤试验,A,D,C,B,阴性（未怀孕）,阳性（怀孕）,加尿样,除去滤器,加胶体金标记抗体,加洗涤液,结果判定,70,免疫印迹法图解,SDS,裂解,病毒,聚丙酰胺凝胶电泳,-,+,95 68 45 12KD,电转印至,NC,膜上,置待测血清中，漂洗；,加酶标抗抗体，漂洗；,加底物,显色,120 41 24KD,71,第四节,放射性核素标记技术,一、常

21、用标记方法,二、标记免疫物的分离与纯化,72,?,R,：放射性核素示踪,高灵敏,不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信,号,(,标记物的放大效应,),?,I,：免疫学反应,高特异,废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体,为结合剂,73,常用标记方法,1,、常用放射性核素,2,、,125,I,的标记方法,直接法（氯胺,T,法）,间接法（连接法）,74,直接法（氯胺,T,法）,OH,-NHCHONH-,CH,2,OH,-NHCHONH-,CH,2,Na,125,I 4,。,C,125,I,氯胺,T,75,间接法（连接法）,CH,2,OH,O,H-C-C-O-N-C-CH,2,H O O=C-C-CH,2,CH,2,OH,O,H-C-C-O-N-C-