微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析

1、2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,欢迎各位同学 批评指正！,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,马放,微生物非培养技术的未知种群 检测与功能解析,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,主要内容,传统环境微生物分析方法面临的挑战 现代环境微生物分析方法发展概述 rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析中的应用 PCR扩增技术的应用 核酸探针杂交技术的应用 DNA指纹图谱技术,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,传统环境微生物分析方法面临的挑战,利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括

2、纯种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,微生物与农业 微生物与工业 微生物与医学 微生物与环境保护 微生物与能源开发,传统环境微生物分析方法面临的挑战,传统微生物培养技术的现状 微生物与人类社会,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改造，

3、实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状的梦想。,传统环境微生物分析方法面临的挑战,传统微生物培养技术的现状 微生物与现代分子生物学,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,基因改造后的工程菌,传统环境微生物分析方法面临的挑战,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,传统环境微生物分析方法面临的挑战,随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16S rRNA技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的线索和思路。,2020/6/27,

4、市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性平板计数异常 (Plate Countanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异。,传统环境微生物分析方法面临的挑战,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,造成平板计数异常的原因： 由于实验室难以再现微生物的自然生存条件 大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的生长,传统环境微生物分析方法面临的挑战,因此，利用

5、传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未培养微生物或不可培养微生物 (Uncultured Microorganism) 。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,微生物的自然多样性 结构多样性 代谢多样性 行为多样性 进化多样性 生态多样性,传统环境微生物分析方法面临的挑战,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,传统环境微生物分析方法面临的挑战,科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105-106。 采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验证来看，海水中可培养的微生物约占0.

6、001%-0.1%，淡水约占0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。 许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养 (Viable but Nonculturable，VBNC) 的状态。 据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。,因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的纯培养技术。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,The omics 组学技术,Genome Transcriptome Proteome Metabolome,现代分子生物学技术,现代环境微生物分析方法发展

7、概述,系统生物学,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,组学技术在微生物群落结构解析方面的应用,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,微生物非培养技术的产生与发展,微生物学家运用非培养方法来研究自然界中的微生物，即避开传统的微生物分离培养方法，利用DNA含有不同的信息内容和信息容量这一特性，直接研究细胞的DNA以获取自然界微生物的多样性及群落组成的信息，及从分子生态学的角度研究未培养微生物在环境中的变化。非培养技术的主要任务在于：革命性地改变了人们对原核生物多样性和自然界微生物群落组

8、成的理解，并提供开发不可培养微生物资源的新途径。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,非培养技术的分类,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,以群落分析为目的的非培养技术,大尺度的分析群落DNA的非培养法有DNA-DNA复性和G+C含量分析两种方法，它们能分别给出所研究微生物群落总的基因多样性和结构的改变。,DNA指纹技术,大尺度群落分析,变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 扩增rDNA限制性分析 (ARDRA) 末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP) 核糖体基因间序列分析 (RI

9、SA),2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,以生物材料获取为目的的非培养技术,1. 基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据 保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该 法方便、简单、快速但不易获得新型基因。,2. 宏基因组技术，即通过对环境DNA构建插入基因组文库，并利用活 性或序列筛选的方法以获取目标基因的新技术。,宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来，而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组测序，有利于我们重

10、新认识有意义但未被开发的生物学过程。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,微生物非培养技术的优势与局限性,微生物非培养技术的优越性,(1) 发现新种 (2) 评价具有重要生态地位的种类 (3) 古菌的研究 (4) 菌种与环境功能的关联,非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来的一些分析难题影响着克隆文库的应用。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,现代环境微生物分析方法发展概述,微生物非培养技术的应用前景,(1) 微生物多样性程

11、度的测定 (2) 生态学和进化 (3) 目标基因的获取 (4) 非培养微生物特征的鉴定 (5) 系统水平理解微生物群落动力学,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中，最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体DNA的基因间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)。,细菌的rRNA 组成,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,细菌

12、的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,Carl Woese,上世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rDNA特征序列，认为16S rDNA及其类似的rDNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,rDNA序列的微生物鉴定主要依据为： rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性且最为古老，而且同时含有保守序列和可变

13、序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是针对16S rDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直接鉴定到属或种。根据核糖体16S rDNA结构变化规律，在所测定的区域中包括了V1、V2、V3、V8共8个高变区，尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区

14、）等。,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,16S rDNA,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,常用16S rDNA序列引物,注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,1980年，Brosius等利用23S rRNA基因序列测定的方法推导出大肠杆菌23S rRNA的全部核苷酸排列顺序，整个分子含有2904个核苷酸。1981年相继有三个实验室提出了大肠杆菌23S rRNA的二级结构模型。目前已经获得了大量有关23S rRNA基因序列的信息，不同来源的23S rRN

15、A约有60%70%的结构共同性。大肠杆菌23S rRNA的一级结构与酵母也有很大相似性。虽然已有大量的大肠杆菌23S rRNA基因序列信息，但是相比于16S rRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中还没有得到广泛的应用。,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,23S rDNA,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析,核糖体DNA的基因间隔区 (ITS区),细菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些间隔序列组成。近十几年来，人们成功的以核糖体大小亚基基因间的间隔序列为对象，对细菌进行更细致的分类和鉴定，并对细菌群落的结构

16、和多样性进行分析。,核糖体DNA的基因间隔区示意图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,PCR扩增技术的应用,PCR扩增原理示意图（左）及PCR仪工作原理曲线（右）,DNA指纹技术通常需要大量的DNA片段，因此，需要一种手段能够同比例的放大混合DNA样品的量。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增几百万倍。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,不同种类的PCR方法,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科

17、学与工程系 马放,巢式PCR技术,巢式PCR原理示意图,巢式PCR (nested PCR)，是指利用两套PCR引物 (巢式引物) 对DNA模板进行两轮PCR扩增反应。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,反向PCR技术,反向PCR的原理示意图,常规PCR是扩增两引物之间的DNA片段，反向PCR（reverse PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,原位PCR技术,原位PCR可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）不同拷贝数目的序列（病毒的或基因组的DNA或RNA），

18、扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统也分为直接和间接两种。,原位PCR的大致流程主要包括： 染色体、细胞及组织切片样品的制备 PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透 PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用反转录PCR d. 原位杂交及检测。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,定量PCR技术,定量PCR技术的方法主要包括：PCR产物的直接定量、有限稀释法、外对照PCR定量、内对照PCR定量、竞争性PCR定量以及荧光定量PCR。其中又以实时荧光定量PCR（Real time Fluorescent Quantitative PCR，

19、RFQ-PCR）的方法应用最为广泛。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,实时荧光定量PCR的两种定量技术原理,定量PCR技术,实时荧光定量PCR的动态变化图（左）和标准曲线图（右）,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,反转录PCR技术,反转录PCR（Reversed Transcript PCR，RT-PCR），是一种将cDNA合成与PCR技术结合，用以分析基因表达的快速、灵敏的方法。,反转录P CR原理示意图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,热不对称交错PCR技术,热不对称交错PCR（Thermal Asym

20、metric Interlaced PCR，简称TAIL-PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。,TAIL-PCR反应流程,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,核酸探针杂交技术的应用,分子杂交技术 (technique of molecular hybridization) 又称核酸杂交技术，是利用现代分子生物学技术手段从分子水平探讨组织细胞内特定基因的表达变化规律，并阐明细胞功能调节机制的一种极为重要的方法，在一定程度上具有其他生物检测技术所不能替代的作用。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,常规分子杂交技

21、术的定义及分类,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,菌落原位杂交,菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA与探针进行杂交反应的方法。,用菌落原位杂交方法进行的FAST Plaque TB实验,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,Southern印迹,Southern印迹杂交的操作流程,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,荧光原位杂交技术,原位杂交 (In Situ Hybridization，ISH) 技术是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切

22、片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。,ANAMMOX污泥中浮霉状细菌荧光原位杂交分析,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,荧光原位杂交技术,荧光原位杂交技术的基本原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与待检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA相互补的核酸探针进行染色体水平上的原位杂交，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。,FISH技术具体步骤,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,荧光原位杂交技术,mFISH技术

23、的实验路线图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,荧光原位杂交技术,利用荧光原位杂交技术观测铁沉积样品中的微生物群落结构,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,生物芯片技术,生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞及蛋白质、核酸等生物分子进行准确、快速、高通量检测。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。,生物芯片各部分高度整合,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,生物芯片技术,生物芯

24、片新技术及其优点,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,生物芯片技术,基因芯片技术的原理,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,生物芯片技术,cDNA微阵列芯片原理图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,生物芯片技术,核酸编程的蛋白质芯片制备原理,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,DNA指纹技术包括：,变性梯度凝胶电泳（DGGE） 温度梯度凝胶电泳（TGGE） 单链构象多态性分析（SSCP） 限制性片段长度多态性分析（RFLP） 末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）

25、 核糖体基因间隔序列分析（RISA） 扩增的rDNA限制酶切分析技术（ARDRA） 随机扩增多态性DNA分析（RAPD）,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,DNA指纹图谱的建立过程示意图,总DNA提取流程示意图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,匹配指纹技术的电泳技术,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,琼脂糖凝胶电泳示意图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,聚丙烯酰胺电泳示意图,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学

26、与工程系 马放,常见DNA指纹技术的比较,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,常见DNA指纹技术的比较,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,变性梯度凝胶电泳 (DGGE),DGGE的原理是：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，因此，将PCR扩增得到的等长DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的变性剂梯度位置，染

27、色后可以在凝胶上呈现为分开的条带，每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同序列的DNA。,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,不同偶氮染料脱色菌群的DGGE指纹分析图谱,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,温度梯度凝胶电泳 (TGGE),DNA指纹图谱技术,TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段。,大熊猫面部菌群的TGGE图谱,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与

28、工程系 马放,单链构象多态性分析（SSCP）,DNA指纹图谱技术,PCR-SSCP技术是1989年日本关谷实验室将PCR反应与单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合而创立的。,活性污泥体系的SSCP指纹图谱,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,扩增片段长度多态性分析（AFLP）,DNA指纹图谱技术,扩增片段长度多态性（AFLP）是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，它可以检测整个生物基因组的多态性。,引物组合E7P16230在F2群体检测结果,2020/6/27,市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放,DNA指纹图谱技术,末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）,末端限制性酶切片段长度多态性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）是RFLP基础上发展起来的新技