二、DNA和RNA的制备

1、第二章 DNA与RNA的制备,第一节 DNA的制备 DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同。,一、DNA在生物体中的存在形式,1染色体DNA：生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少 * 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达 2病毒和噬菌体DNA 构建克隆载体，分离目的基因,3质粒(Plasmid)DNA（染色体外遗传物质） 特点：能自我复制，大小

2、不一，在体内以超螺旋形 式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。 用途：构建克隆载体，分离目的基因 4叶绿体和线粒体DNA 构建克隆载体，分离目的基因,二、天然DNA的提取,1.准备生物材料： 选取的材料提取DNA得率最高的生长期，或是DNA容易提取或含量高的组织 细菌对数生长期后期 植物幼嫩组织、暗培养12天 肝脏清除胆囊（含高活性的酶） 2.裂解细胞: 原核生物溶菌酶，NaOH/SDS，煮沸，冰冻，超声波 动、植物 粉碎,3.分离和抽提DNA: 1）提取总DNA 加蛋白质变性剂 2）提取叶绿体或线粒体等细胞器的DNA、病毒和噬菌体DNA： 先需要分离出完整的细胞器、病毒和噬菌体，提取DNA

3、之前还需DNase处理，水解其它的DNA,3） 提取质粒DNA：使其与染色体DNA分开,调节细胞裂解液的pH值达到12.6,再调节pH值至中性,所有DNA变性沉淀,质粒DNA复性后从沉淀中释放出,(一)、细菌总DNA的制备(Escherichia coli),1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani) 培养基，于37C培养至对数生长期,然后置冰水浴20min 2.收集菌体: 离心(5000g, 5 min) (50ml) 3.菌体裂解: 加5ml冷 TES (0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.15M NaCl,pH8.0)加10 mg 溶菌酶,于3

4、7C温 育10min,4. 去RNA: 加入1 mg RNase于50C温育15 min 5. 去蛋白: 加入0.6 ml、10% SDS和Protease K(0.1 mg/ml)，60 C、30min；加苯酚-氯仿抽提(等体积) 6. 沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇；以玻璃 棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中,(二)、细菌质粒DNA的制备,常用的碱法、煮沸法、SDS等均可； 选择何种方法制备质粒DNA，视不同的菌株和不同大小的质粒DNA分子以及以后进行的不同实验等具体情况而定： 菌株类型：如大量提取HB101、TG1菌株中的质粒，不宜用煮沸法；, 质粒的

5、大小：大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理或化学作用破坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法，细菌悬浮液中含有10%的蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力。 细菌染色体DNA变性条件强弱的控制：碱法是最常用的质粒DNA提取方法，它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提取的质粒DNA产量高、纯度好。,碱裂解变性法：,1. 菌体培养：将活化的菌体接种于含一定浓度 抗生素的LB培养基中，于37C培养至对数生 长期后期，然后置冰水浴20 min。 1) 常用的抗生素及其使用浓度 氨苄青霉素：（Ampericillin, Ap） 50-150 g/ml

6、链霉素： （Streptamycin, Sm） 25-50 g/ml 四环素： （Tetracycline, Tc） 10-50g/ml 氯霉素： （Chlorampenicol, Cm）20-170 g/ml 卡那霉素： （Kanamycin, Km） 25-50 g/ml,2) 常用的质粒载体及其起始复制序列（复制子） 质粒 起始复制序列 拷贝数 pBR322 pMB1 15-20 pUC pMB1 500-700 pACYC p15A 10-12 pSC101 pSC101 5 COLE1 COLE1 15-20,3) 质粒的相关概念,严谨型质粒：质粒（如pSC101）的复制依赖于宿主细

7、胞提供的蛋白和质粒自身编码的蛋白的共同作用。 松弛型质粒：质粒（如pUC系列）的复制并不需要质 粒编码的功能蛋白，而是完全依赖于由宿主提供的半衰期较长的酶，当蛋白的合成停止时，复制仍然进行。 拷贝数：质粒在细胞内存在的数量。,如果待提取的质粒属于松弛型复制的质粒，可在扩大培养3-4h后，培养液中加入Cm (终浓度150-170 g/ml)，继续培养10h作用，可以达到质粒扩增的目的。,？,Cm严重超标： 乳品、猪肉、水产品等,2收集菌体 离心(5000g，5 min) 3细胞裂解 DNA变性：悬浮于冰预冷的含葡萄糖的TE缓冲 液中加入裂解缓冲液(1% SDS, 0.2 M NaOH) 4质粒D

8、NA选择复性 加入1/10 V浓度为3 mol/L NaAc (pH 4.8) 5. 去蛋白 以等体积的苯酚- 氯仿抽提 6DNA的沉淀 加入2V的无水乙醇，室温30 min，离心(12000g，15min)，沉淀以70% 乙醇洗涤 7沉淀溶TE buffer中,SDS：分离DNA时常用的一种阴离子去垢剂，有4种作用：, 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； 对RNase、DNase有一定的抑制作用； SDS能够与蛋白质结合形成R-O-SO3 - R-蛋白复合物，使蛋白质变性沉淀； SDS分离DNA时，0.1%和1%的SDS的作用效果不同，前者只将

9、RNA分离出来，后者可将DNA和RNA一起分离出来,苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）,* 苯酚是一种蛋白变性剂，在酸性环境溶解DNA。因此， 在使用前以Tris碱平衡至pH7.8。 * 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分离, 异 戊醇有助于消除提取过程中出现的泡沐抽提 * 加入终浓度为0.1%的8-羟基喹啉，是一种抗氧化 剂，RNase的部分抑制剂及金属离子的弱螯合剂。,*苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离,因为苯酚呈酸性，并且常常与空气接触氧化成粉红色的醌，醌能够形成游离的自由基，这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂，造成DNA降解。直接用于DNA的分离，会使DNA遭到破坏，所以，

10、用前需要重蒸去除氧化物，然后用Tris-HCl饱和酚，并调整pH到中性；用缓冲液饱和酚还有第二个作用，就是防止酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。 重蒸酚中加入0.1%的8-羟基喹啉及少量-巯基乙醇，目的：可以防止酚的氧化；抑制RNase活性，及金属离子的螯合作用,乙醇沉淀DNA的原理：乙醇使DNA分子脱水；,用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，目的是： 中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力。,（三）、噬菌体DNA的提取,（三）、 噬菌体DNA的提取,提取DNA一般是先将溶原菌培养至一定密度，通过热诱导，使DNA从宿主染色体DNA

11、上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量的噬菌体，从中提取线性的DNA。 溶原菌诱导培养 分离噬菌体 DNA的提取,（四）、植物细胞基因组DNA的制备,1细胞的制备：取新鲜的植物组织置于暗处1-2 d，以无菌水洗净后，于液氮中冻结，再用研 钵研成粉末,2细胞的裂解：加入抽提缓冲液（0.1M Tris-HCl, pH8.0；0.1M EDTA；0.25M NaCl；100 g/ml Protease K）加入终浓度为1% 的SDS， 于55C，12 h 3. DNA的沉淀： 上清液中加入0.6 V 的异丙醇, 于-20C，保持30min。离心(7500g,10 min),4. DNA的纯化: 沉

12、淀中加入TE 缓冲液和CsCl2,冰水浴30 min 离心( 7500 g, 10 min) 上清液中加入0.5 ml(10 mg/ml)的溴化乙锭 离心(7500 g, 10 min) 上清液于室温离心(300 000 g)过夜,收集DNA带 以CsCl饱和的异丙醇反复抽提 DNA,除去EB 加入两倍体积的水和6倍体积的无水乙醇 离心(7500 g, 10 min) 沉淀溶于TE缓冲液中 (10-40 g DNA/g fresh cell),（五）、动物细胞基因组DNA的制备,1细胞制备：切下组织块并立即剪成小块，置于液氮中 冻结，然后在预冷的研钵中研成粉末。 2. 细胞裂解：加入消化液（1

13、.2 ml/100 mg），充分混匀 后置于50OC振荡温育12-18 h裂解液: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0；25 mM EDTA；0.1 M NaCl； 0.5% SDS； 0.1 mg/ml Protease K 3. 去蛋白：等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提,振荡的方式混合有机相与水相,DNA 30 kb,置于转鼓缓慢转动(20 r/min),轻轻摇动混匀,4DNA的提取：上清夜中加入0.5 V的7.5 M的NH4Ac，2 V 无水乙醇，离心(5000g，10min) 沉淀以70%的乙醇 洗涤,5DNA的溶解：DNA沉淀干燥后溶于TE Buffer,1

14、、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法 适于纯化大剂量DNA，纯度高；但需要超速离心机、昂贵的氯化铯、纯化时间长。 操作步骤如下： DNA溶液置于一离心管中，每毫升加1g固体氯化铯，30下缓慢溶解，再加溴化乙锭溶液（10mg/ml）至终浓度0.7mg/ml。溶液中氯化铯终浓度为1.55g/ml，折射率为1.3860。,三、DNA的纯化, 室温下8000r/min离心5min，吸取液面浮渣下的清液置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上，20下以45000r/min离心3640h。 在紫外灯下观察待纯化的DNA带。在DNA带下方用21号针头剌穿离心管壁收集DNA。 在收集的DNA液体中加入等体积、水饱

15、和的正丁醇，充分混匀，以1500r/min离心3min，吸取下层水相。如此处理46次，直到水相液体在紫外灯下无橘红色。 透析除去DNA液中的氯化铯, 用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA。DNA在低盐浓度（0.10.5 mmol/L NaCl）下能与树脂结合，当层析柱平衡后，可用0.5-2.0mmol/L的梯度浓度NaCl溶液洗脱DNA，再经透析除去NaCl。 用羟基磷灰石纯化DNA。在低盐浓度溶液中，DNA和RNA的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子的相互作用，使其结合在羟基磷灰石层析柱上，随后用浓度梯度磷酸盐溶液洗脱和回收DNA或RNA。,2、离子交换层析法,3、琼脂糖凝胶电泳洗脱法 4、“基

16、因纯”试剂纯化 5、从DNA样品中去掉EB 正丁醇（或异戊醇）抽提法：向DNA样品溶液中加入等体积用溶解DNA缓冲液饱和的正丁醇，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上相正丁醇。重复以上步骤至少一次，直到上相正丁醇无桔红色。, Dowex树脂层析法：加入DNA样品，再用TES缓冲液(Tris-HCl20mmol/L，pH8.0；EDTA5mmol/L；NaCl 200mmol/L)洗柱，分部收集0.2-0.5ml组分的洗脱液，经过透析和沉淀，可得无EB的DNA。,1、乙醇沉淀法 在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇，使DNA沉淀。 2、正丁醇抽提法 加入1体积的正丁醇，充分混匀，以1

17、600r/min离心1min，弃上相液体。如此重复至液体达到所需要的体积。然后用水饱和的乙醚抽提DNA溶液两次，去除正丁醇。最后空气中蒸发乙醚。 3、用聚乙二醇浓缩法,四、DNA的浓缩,五、利用PCR制备特异的DNA片段,1.原理： PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）在耐热DNA聚合酶的催化下，以变性的双链DNA中的一条链为模板合成互补的DNA链。,2.反应系统: 耐热DNA聚合酶，DNA模板，dNTPs, 引物，Mg2+,3.反应过程： 变性：双链DNA在高温(94C)下变性为单链DNA 退火复性：在较低的温度(37-65C)下,引物与变性的单 链D

18、NA通过碱基互补作用而特异性地结合 DNA延伸：在较高温度下(70-75C)下,耐热DNA聚合酶催 化互补链从引物3-OH端开始沿53方向合成互补链,利用PCR扩增特异性DNA片段过程,PCR反应液组成,PCR反应条件,PCR反应结果,第二节 RNA的制备,来源于任何细胞的RNA都可以通过反转录酶的作用拷贝成双链DNA并克隆化，获得相应的于特定细胞来源的cDNA文库。因此，RNA制备的意义有两个方面： * 获得特定细胞来源的cDNA文库，克隆目的基因 * 分析基因的表达，阐明基因调控的特性，了解从基因 转录产生RNA的结构，数量，水平及合成的速率,RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染

19、,RNA酶的特点及其存在形式： 特点： 是一类生物活性非常稳定的酶类；耐热、耐酸、耐碱；煮沸也不能完全失活；蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性 RNase的活性不需要辅助因子，二价金属离子螯合剂对它的活性无影响 存在： 细胞内RNase；环境中灰尘、人体的汗液、唾液；实验中RNase造成的污染，污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及试剂等 措施： 严格控制外源性RNase的污染；最大限度的抑制内源性RNase的活力,抑制RNA酶活性的方法,灭菌法： 将RNA提取过程中使用的器具进行高温灭菌处理(180 C，8h)， 溶液等在高压下蒸汽灭菌15min (1.0

20、34 105 Pa) 2. 焦碳酸二乙酯（DEPC）抑制法： DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h，然后以灭菌水淋洗数次，在100 C下干烤15min。,抑制RNA酶活性的方法,利用RNA酶蛋白质抑制剂与RNA酶紧密结合防止其发挥酶活作用； 利用氧钒核糖核苷复合物与RNA酶结合； 利用硅藻土吸附RNA酶。,3. RNA酶抑制剂法：,一、细菌RNA的制备,1菌体培养 同上 2. 离心收集菌体 菌体经离心（5000g，5min）后，悬浮于终止 缓冲液中（200mM Tris-HCl，pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20

21、mM 金精三羧酸(ATA)） 3. 菌体裂解 加入STET缓冲液(8%蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)悬浮加 入0.2M的VRC(0.2M和10mM的氧钒核苷复合物),4. RNA提取 加入0.5 V的苯酚振荡1 min，0.5 V氯仿振荡1 min，10000g，10min,水相加入1/10 V的NaAc， 2 V的无水乙醇10000g，10 min沉淀溶于0.2 M 的VRC，以酚-氯仿抽提两次 5. RNA纯化 重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中，加 入CsCl溶液，于室温离心(200 000g,1h)回

22、收RNA 沉淀,溶于DEPC处理的水中，加入1/10 V的3M的 NaAc，2 V的乙醇，离心 6RNA的溶解 将RNA沉淀溶于水中,二、植物组织细胞RNA的制备,1.细胞处理: 将植物组织置于液氮中冻结，研 成粉末，加入匀浆缓冲液，高速匀浆，后高速 离心（20000g，10 min） 2.RNA提取：上清液中加入皂土(4%),等体积的酚, 低温振荡5min，200000 g、10 min 3.重复该步骤一次 4.RNA沉淀: 于上清液中加入KAc至终浓度为0.2 M,加两倍体积的无水乙醇,于0C 30 min， 30000g、20 min 5RNA的溶解：沉淀溶于水中或TE缓冲液,三、哺乳动

23、物细胞质RNA的制备,1细胞培养: 人工组织培养 2细胞裂解：以含磷酸缓冲液（PBS）的生理盐 水洗细胞悬浮于预冷的溶胞缓冲液中，加入 24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞缓冲液 3去蛋白： 加入Protease K，于37 C温育30 min，酚抽提 4去DNA：乙醇沉淀,悬浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS) 5. 沉淀RNA: 加入终浓度为0.3 M的NaAc, 2V无水乙醇于-20 C 2h, 离心收集RNA。,四、mRNA的分离提纯寡聚(dT)-纤维素柱法,上柱缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6) 0.5 mol/L NaCl 1 mmol/

24、L EDTA (pH8.0) 0.1% 十二烷基肌氨酸钠 洗脱缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.05% SDS,寡聚(dT)-纤维素柱法提纯mRNA的过程,柱平衡（以上柱缓冲液洗脱纤维素柱，至柱流出液 的pH值小于8.0) 装柱( RNA水溶液于65OC温育5min，迅速冷却后按1V RNA水溶液 + 1V 上柱缓冲液（2）混合装柱 预洗(以5-10V的上柱缓冲液将未与柱结合的RNA等 洗脱下来，至OD260为很小或为零） 洗脱(以2-3V的无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱柱，并进 行分部收集) 沉淀(1/10 V的3M NaAc，pH5.2；2V 无水乙醇； 置于冰浴中至少30min) 溶解 (重蒸水或TE中),RNA干扰 RNA interfering,2006年10月2日，47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interfere