嗜热微生物的研究进展及应用

1、嗜热微生物的研究进展及应用宜春大学化学生物工程系03生物教育张志刚老师：江安摘要嗜热是从嗜热微生物中分离出来的一种热稳定性酶，具有45C以上的最佳生长温度的微生物，在嗜热酶分子内部有很多氢键、双硫键和坚硬、韧性强的空间结构，因此高温条件下高温热酶具有很强的稳定性，高温反应活性，有机溶剂，去污剂和变性剂的强烈阻力，嗜热酶在很多方面目前获取嗜热酶的方法主要是从嗜热微生物中直接提取，利用基因工程技术在中温宿主中表达，利用定向分子进化技术筛选。目前酶的精制主要使用色谱、高效液相色谱、电泳等方法。环境恶化、能源危机、全球变暖等因素将进一步诱惑thermophila的开发和应用。关键词嗜热微生物；嗜热酶；

2、弧热机制；应用thermophilic microorganism research progress and applicationChemistry and bio engineering，bio工程，科学学院Advisor : Jiongabstract thermophilic microorganism s is a type of microorganism s that The most suitable growth temperature is above 45c，The thermophilic enzicthe method which obtained the ther

3、mophilic Enzyme includes three kinds at present 3 3360 distilled directly from the thermophilic microorganismdue to The cause of worsening environment，energy crisis，warmer weather，The development and application of The thermophilic enzymeKeywords热塑性微观组织；热学enzyme热塑性机械；应用程序具有45C以上最佳生长温度的微生物称为嗜热微生物，是在高

4、温环境下生存的微生物种类，有自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制和代谢产物，是地球上边缘生命。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一种热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，特别是在高温条件下保持良好的稳定性，实现了许多高温化学反应，极大地促进了生物技术产业的发展。近年来，人们从嗜热微生物中分离出多种嗜热酶。今后还应继续对嗜热酶的结构、功能、应用等进行深入而全面的研究。本文主要综述了嗜热酶的研究进展和应用。1号隐性微生物的分类及其酶的种类和特性1.1号隐性微生物分类嗜热微生物是在40 150下生长的微生物，可分为轻微嗜热(最佳生长温度不到60 )、中度嗜热(最佳

5、生长温度不到85 )和极度嗜热(最佳生长温度不到85 )，主要是地热环境(海底温泉和陆地温泉)据济班报道，能产生嗜热蛋白酶的嗜热微生物中，芽孢杆菌最多。例如，Bacillus sp.mo21、b.sp.ea.1、B. thermoprotolyticus、B. licheniformis和b.circulans、b.sp.ak1、b.sp.b18、b . ss1.2号隐性酶的种类热敏酶有多种，多种酶作用多样，目前开发中的热敏酶有：1)分解淀粉的热敏性淀粉酶，热稳定性糖化酶(1，4-glucanohydrasses)2)分解纤维素的嗜热酶：热稳定性纤维素酶；3)热稳定性xylanase(xyla

6、n ases)；4)分解甲壳素的热稳定性酶：热稳定性甲壳素酶；5)分解蛋白质的热稳定性酶：热稳定性蛋白酶；6)葡萄糖异构酶和木糖异构酶(xy lose isomers AE)；7)DNA聚合酶等3。1.3号隐性酶的特性嗜热酶是一种热稳定酶，主要来源于嗜热微生物，在高温下保持长时间活性不变，其特征是3:1)作用的最佳温度高嗜热酶作用的最佳温度大部分在60 80 之间，但也有一些例外。例如，Bacillus sp。B18的嗜热蛋白酶具有最佳温度85c4；磷：嗜酸热菌的thermo蛋白酶提供95c5的最佳温度。最值得注意的是，Pseudomonas sp。的热霉素是最佳温度为120c6。(2)耐热性

7、好。例如，Bacillus sp。AK1产生的蛋白酶AKl在60、70 时酶活性没有变化，在90 时酶活性半衰期为19分钟7；嗜热蛋白酶由嗜热sp.e79产生，在90 时10分钟8；Thermus sp。Rt41A产生的嗜热蛋白酶在70 时的酶半衰期为24小时9。(3) PH和热稳定性(如嗜热蛋白酶sp.e79产生的嗜热蛋白酶，ph 5.0 12.0范围内酶活性相当稳定8；Bacillus sp。B18产生的嗜热蛋白酶在ph 5.0 12.0范围内酶活性也相当稳定4；嗜热蛋白酶由嗜热杆菌hy269产生，其pH稳定范围为70，80 ，pH稳定范围为pH6 .0到10.0，ph 6.0到8.0 1

8、0。2号隐性酶热稳定性机理嗜热酶的耐热性主要由分子内部结构决定。维持嗜热酶内部三维结构的化学键主要与氢键、二硫化物键的存在以及数量和热稳定性有关。一般认为，这种结合存在，其数量增加，酶的热稳定性提高。如果这种结合分离，酶的热稳定性就会下降或丧失。嗜热酶分子的许多微妙结构可能与它的稳定性有关。其中包括稍长的螺旋结构、由三股组成的-折叠结构、c和n端氨基酸残基之间的离子作用、较小的表面环等。这种结构形成了嗜热酶致密、有韧性的空间结构，提高了其稳定性。酶蛋白为了适应热环境，结构发生了变化，但各酶的热适应机制不同。部分酶在高温下结构重新排列，部分空间短程组相互作用，堆积结构进一步优化，内部空数和体积减

9、少，在分子内部形成疏水强的疏水核，同时分子外部极性表面积增加，有利于提高嗜热酶的稳定性11。3号隐性酶的获取3.1从嗜热微生物中直接提取在特殊的高温环境下(例如堆肥、培养材料、锯屑堆、树、土壤、空气、动物巢、动物粪便、动物身体、昆虫等)，分离出嗜热微生物，然后直接从嗜热微生物中提取嗜热酶。3.2利用基因工程技术在中温宿主中表达在嗜热微生物中利用基因工程技术在中温宿主中成功表达目的基因，可以在温和的培养条件下获得很多嗜热酶，克服嗜热微生物生长速度慢、培养条件严格、难以获得很多嗜热微生物的困难。现在，嗜热微生物中获得的一些基因在大肠杆菌等中温宿主中成功表达12。3.3利用定向分子进化技术筛选克隆的

10、基因在体外诱变和重组，得到了很多突变，被中温宿主表达后，在高温条件下筛选具有催化活性的突变的定向分子进化技术是获得嗜热酶的新方法。4号隐性酶纯化目前酶纯化主要使用色谱：4.1离子交换色谱。离子交换色谱法根据蛋白质和离子交换机结合力分离蛋白质。使用此方法可以有效地纯化嗜热酶。例如，孙草等10成功地用CM-纤维素色谱分离了芽孢杆菌HY269的耐热金属蛋白酶。4.2亲和层析。亲和层析是精制质量非常有效的方法，通常只需处理一步就可以达到精制目的。蛋白质根据蛋白质及其配体亲和力的大小分离。也就是说，目的蛋白具有较强的亲和力，停留在色谱柱上，目的蛋白由于亲和力小而被溶出。例如，晋城等13使用Cbz-L-L

11、-Phe-T-se pharose 4B亲和层析柱分离纯化嗜热金属芽孢杆菌HY269中的耐热金属蛋白酶。4.3凝胶过滤色谱。根据蛋白质分子大小分离蛋白质。这也是有效纯化嗜热酶的方法。例如糖等14使用Sephadex G50凝胶柱从嗜热菌WF146中纯化耐热中性蛋白酶。4.4离子交换色谱和凝胶过滤色谱。目的蛋白在分离纯化过程中与非目的蛋白具有相同的电荷特性或分子量相同的情况较多。这使一步离子交换色谱或凝胶色谱无效。两种方法结合后，得到满意的结果。例如，香豆素cg 15是离子交换色谱、凝胶过滤色谱法纯化嗜热碱性蛋白酶。精制嗜热酶除了色谱外，还有高效液相色谱，电泳。最值得关注的是利用：Manro G

12、K等9基因工程技术构建有助于净化嗜热酶的融合蛋白。5号隐性酶的应用使用嗜热酶作为生物催化剂，可以降低以下优点：(1)酶制剂的制造成本。由于嗜热酶的稳定性高，可以在室温下分离、纯化和包装运输，并且能保持很长时间的活性。(2)运动反应加快了。反应温度越高，分子运动速度越快，酶催化能力越强。(3)反应堆冷却系统的要求标准低，降低了能耗。嗜热酶具有耐高温性，因此生产不需要复杂的冷却装置。一方面节约了支出，一方面降低了冷却过程对环境的污染。(4)提高了产品的纯度。在嗜热酶催化反应条件(70 以上)下，细菌很少生存，减少了细菌代谢产物的污染。(5)生物化学过程在高温下进行，增加淀粉、纤维素、脂质的溶解性和

13、可利用性等不溶性物质，减少有机化合物的粘度，有助于物质的扩散和混合。基于高温性酶的高温反应活性和对有机溶剂、洗涤剂和变性剂的强烈抵抗力，在很多方面具有广泛的应用前景。5.1食品酿造业在食品加工过程中，通常要经过脂肪水解、蛋白质消化、纤维素水解等处理过程16。嗜热蛋白酶、淀粉酶及糖化酶在食品加工过程中已经发挥了重要作用。一些耐热的-淀粉酶被用于淀粉加工、酒精、啤酒和其他发酵工业生产。高温水解酶为食品产业带来活力，消化蛋白酶加工纤维，使食品更加美味健康。在啤酒中应用-葡聚糖酶可以提高麦汁分离速度，降低啤酒浊度，减少交米沉淀。嗜热链球菌是从牛奶中检测抗生素的TTC方法，是生产特定菌的酸奶，培养与保加利亚菌混合产生芳香细胞膜的酸奶。-galactosidase可用于生产低乳糖食品，改善乳制品的味道和营养，还可用于水解过程中发生反式糖苷反应，生成功能丰富的低聚乳糖(GOS)17。5.2造纸工业传统的方法是用强酸或强碱处理木桨，大约90%的木质素能水解。嗜热菌热原菌中可获得分离1，4-木糖酶，最佳温度为105 ，用该酶处理木浆可有效去除木质素，减少化学漂白剂的用量18。5.3环境保护环境保护主要是指处理食品和造纸工业废水、芳香化合物、氰化物、有机磷农药、重金属和其他有机可降解物质19。利用防热酶处理木浆，可以有效地去除木质素，减少化学漂白剂的用量，减少对环境的污染。在