细胞培养 第一章 组织培养技术的基本理论知识

1、，组织细胞培养技术，主讲人：周，第1章，细胞培养的基本理论知识，组织培养始于20世纪初，哈里森(1907)首先对两栖动物胚胎的神经管组织进行悬滴培养哈里森悬滴培养真正开始大规模细胞培养是在20世纪40年代，当时厄尔和杜尔贝科设计了细胞培养液的配方并开始进行。细胞培养于20世纪30年代首次引入中国。自20世纪50年代以来，组织培养在中国逐渐发展起来。组织细胞培养的诞生和发展简史。第一节细胞培养的基本概念。首先，细胞培养的基本概念：细胞培养是指从动物体内取出细胞或组织，模拟体内生理环境，并使分离的细胞或组织在无菌、适度和丰富的营养条件下存活、生长并维持其结构和功能的技术。体外培养，组织培养，器官培

2、养，细胞培养，细胞培养：细胞(包括单细胞)的体外生长。组织培养的初衷是从体内取出组织，模仿体内的生理环境，使其在无菌、适当的温度和一定的营养条件下存活、生长并维持其结构和功能。注意：组织培养和细胞培养没有严格的区别！器官培养(Qrgan Culture)，是指应用类似条件和组织培养，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使其在体外生存、生长并保持一定的功能。细胞培养技术已经广泛应用于遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域。多莉，克隆猴，单克隆抗体制备工艺，优点：1。活细胞：能长期直接观察和研究活细胞的形状、结构和生命活动；2.细胞培养的优缺点；2.可控性：选择对象：均匀性和重复

3、性；哪一种：类型：上皮细胞？间质？自然：正常吗？肿瘤？阶段：调控条件：物理、化学、生物等可控因素；研究方法：可采用多种研究技术和记录方法；3.广泛的应用：许多学科和广泛的对象。4.经济性：可提供大量生物学特性相似、重复性好的实验对象。缺点：虽然现在对内部环境的人工模拟技术很高，但人工模拟的条件与体内的实际条件并不完全相同。细胞在体外培养时，长期生活在缺乏动态平衡的环境中，这种环境不可避免地会发生变化。1。它主要不同于机体，相对孤立，相对单一，缺乏对体内系统的利用，失去了神经体液的调节和细胞的相互影响。2.主要表现为原始组织结构和细胞形态丢失，分化减弱或不明显，细胞趋向单一；3.建议正确理解体外

4、培养的细胞：它们是在特定条件下生长的细胞群体。第二部分是关于文化的生长生物学。首先，根据生长模式，体外培养的细胞的生长类型可分为两种：贴壁细胞：其仅当附着于固体支持物的表面时才能生长。悬浮细胞：是能够在悬浮状态下生长而不附着于固体支持物表面的细胞。大多数有机体细胞是附着细胞。贴壁细胞：贴壁：是大多数生物体细胞在体内生存、生长和发育的基本方式。大多数有机体细胞必须附着在固体表面才能生存和生长。细胞在体内和体外的黏附方式不同：在体内：黏附是全方位的，形状具有复杂的三维特征。体外：在大多数情况下，细胞只有一个粘附平面，其形状通常与体内明显不同。根据培养细胞的主要形式，它们可分为以下类型：(1)上皮细

5、胞(2)成纤维细胞(3)迁移细胞(4)多态细胞。(1)上皮细胞(2)成纤维细胞(3)移行细胞(4)多态细胞，(1，2，3，4)，上皮样细胞类型，名称：仅在形态学上，但实际上并不完全等同于来源：从外胚层，内胚层细胞(有一些例外)，如皮肤及其衍生物，消化道，中间有一个圆形的细胞核，其生长特点是容易连接成碎片，相互靠近，薄层，铺路石时像膜一样移动， 很少脱离细胞群而单独移动，成纤维细胞样细胞，名称：来源，其形状类似于培养物中成纤维细胞的形状：来源于中胚层间充质组织的组织，例如：真正的成纤维细胞心肌、平滑肌、成骨细胞、形态学：它类似于体内成纤维细胞的形态学。 细胞质呈纺锤形或不规则三角形，细胞质向外突

6、出。在2-3个不同长度的突起中有椭圆形核。生长特征呈放射状排列，涡旋形状没有紧密连接成一片。细胞与细胞的接触很容易断裂，但是独立运动的成纤维细胞样细胞是自由的，并且通常有几个细长的细胞突起。体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞和迁移细胞具有与巨噬细胞相似的特征。经常处于一种更加活跃的变形和游移状态，所以形状是不规则的，不断变化的。当细胞密度增加并连接成碎片时，迁移受到限制，这在形状上类似于上皮细胞或成纤维细胞。具有这种形态的细胞主要是吞噬单核吞噬细胞系统细胞，如颗粒白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、枯否细胞和一些肿瘤细胞。多态细胞多态细胞是一些具有不规则形态的细胞，但与成纤维细胞不同，不规则形态

7、是由宽而平的胞质突起引起的。它的细胞一般分为两部分：细胞体和细胞突起。细胞突起细长，像丝状假足。虽然细胞体略呈多边形，但不像成纤维细胞那样不规则。神经元和神经胶质细胞是体外培养中最常见的多形细胞类型。注意：细胞形态不是固定的，但可以随着培养条件、生长期、细胞数量等而变化。细胞形态只是判断或鉴定培养物的参考指标。为了确定特定培养物的确切细胞类型，必须使用更具体的鉴定方法，如组织化学或免疫细胞化学染色。，培养细胞的形态不稳定。血清Hela血清含量高，血清含量低。成纤维细胞样上皮细胞pH Hela太酸性或太碱性。标准酸碱度成纤维样上皮细胞细胞密度3T3低密度和高密度成纤维样上皮细胞改变其生长状态。悬

8、挂的或附着的。悬浮的、附着的、附着的、圆形的、成纤维细胞的或上皮样的、转化的或非转化的、转化成成纤维细胞的。上皮样，悬浮生长型，悬浮状态下生长，在概念培养过程中不附着于底物，来自血液、脾脏或骨髓，尤其是血液中的白细胞。肿瘤细胞的特征还可以是圆形细胞、在悬浮液中生长良好的单个或小细胞群、大生存空间、大量传代、方便(不消化)和容易收获的优点、不方便观察的缺点、许多细胞不能在悬浮液中生长(尤其是正常细胞)、概述：体外培养细胞的生长类型、贴壁细胞、悬浮细胞：血细胞和一些肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、迁移细胞、多形细胞、 培养细胞分化状态的改变，分化特征的逐渐减弱，原有的各种分化细胞，逐渐失去各自的形

9、态和功能“个性”，表现出一定的趋同性，这种现象称为去分化培养细胞的去分化或增殖能力，而分裂、增殖和生长发育是体外培养细胞的两个方面，其增殖能力一般与体内这类细胞相似。 培养细胞的生长和增殖过程，1)单细胞生长过程：DNA合成细胞分裂综述：细胞周期=G1 s G2 m2)培养细胞的生长过程，原代培养期，传代期，衰退期，细胞周期：指从前一次分裂结束到当前分裂和管束形成的过程。它可分为四个时期，即：DNA合成期(S期)、有丝分裂期(M期)、从有丝分裂完成到DNA合成开始的间隙期(G1期)、从DNA复制结束到有丝分裂开始的间隙期(G2期)。如果由于某种原因(如缺氧、血液饥饿等。)细胞不再沿着细胞周期运

10、行，而是进入休眠状态，这被称为G0期。体外培养细胞的整个生命过程分为几个阶段。原代培养：从活体新鲜组织中取出并在体外生长的细胞称为传代前原代培养。继代培养：细胞在培养容器中生长一段时间，然后分别接种到新的培养容器中进行进一步培养的过程。原代培养，传代培养，选择生长良好的细胞，加入胰蛋白酶消化液，显微镜下观察，倒出酶液，加入培养液，反复吹制成细胞悬液，然后按比例分割培养。2)每代附着生长细胞的生长过程，自由期附着期的潜伏期是对数生长期(平台期)的停止期，1。自由期：细胞接种后悬浮在培养液中，此时细胞质收缩，细胞体呈球形。时间：10分钟-4小时。2.附着期：细胞附着在基质上，自由期结束。基质：玻璃

11、、塑料、胶原蛋白、其他细胞等。3.在培养期间，细胞有生长活性，但没有细胞分裂。细胞系的潜伏期一般为6 24小时。4.对数生长期：细胞数量随时间呈指数增长，活力最好，最适合实验研究。5.停滞期(plateau period):细胞充满瓶壁后，细胞活跃但不再分裂：接触抑制、密度限制，每一代细胞的生长过程分为几个阶段，第三部分是培养细胞的生存环境和条件，1。细胞的营养需求：1)基本营养：氨基酸(12种谷氨酰胺)、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖和其他无机离子等。2)体外培养动物细胞最常见的温度是37。耐低温和耐高温！在生理温度范围内，温度与细胞生长率呈正相关。(综述：温度对酶促反应的影响)，2)气相环

12、境对细胞生长的影响，动物细胞培养的气相环境采用5%CO2和95%空气的混合气体(提供氧气)。O2参与细胞的能量代谢。二氧化碳用于维持培养液的酸碱度。一般来说，这是一种开放的文化。3)培养液的酸碱度对细胞生长的影响，大多数生物细胞能在酸碱度6.0 8.0之间存活。最适宜的酸碱度范围是7.2 7.4。体外培养的正常细胞耐酸性强于耐碱性。4)无污染、无毒(前提条件！)，组织培养的常用术语，细胞培养：细胞(包括单细胞)在体外的生长称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织，但在口语实验室中，人们通常将其扩展到组织培养和器官培养。附着依赖性：细胞为了生长需要附着在基质或支持物上的特性。原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养传代(继代培养或继代培养)将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中，称为继代培养或继代培养。悬浮培养：细胞或细胞聚集体悬浮在液体培养基中进行增殖的一种培养模式。细胞融合在体外培养中，两个独立的细胞通过化学试剂、病毒或物理方法诱导融合成一个细胞。汇合：细胞相互连接并占据所有基质区域。不要将其与细胞融合混淆。亚融合：细胞在基质上紧密生长，但尚未完全融合。细胞系(细胞系)原代培养物