细胞生物学研究方法ppt课件

1、医学细胞生物学(第5版)第3章细胞生物学的研究方法，上次第1节显微镜技术第2节细胞的分离培养第3节细胞成分的分离和培养，这次课的主要内容，第4节细胞化学和细胞内分子示踪技术第5节细胞功能基因组学研究技术第6节生物大分子的结构测定第4节细胞化学和细胞内分子示踪技术， 细胞化学技术(cytochemistry technique )结合细胞形态观察和细胞成分分析，在保持组织和细胞本来结构的同时，利用生物高分子、小分子、无机离子的物理、化学特性研究其在细胞内的分布、数量水平的动态变化。 细胞化学技术不是单一技术，而是一组酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、原位杂交技术等相关技术，而酶细

2、胞化学技术是通过酶的特异细胞化学反应显示酶在细胞内分布和酶活性强弱的技术。 光镜样品：固定(酶固定结构固定)冷冻切片细胞化学反应(酶反应捕捉反应)光镜观察电子显微镜样品：固定(酶固定结构固定)组织切片细胞化学反应(酶反应捕捉反应)脱水包埋极薄切片电子显微镜观察，例如过氧化物酶peroxidase，(POX ) 1 .原理血球中的POX分解H2O2释放出新的生态氧，后者氧化联苯胺，使联苯胺沉淀成细胞质酶活性。 2 .正常阳性细胞： .中性粒细胞呈均匀颗粒状的蓝黑色阳性。 嗜酸细胞呈均匀粗大粒子状的蓝色阳性。 单核细胞呈分散颗粒状的蓝色阳性。中性粒细胞为粗颗粒强阳性，单核细胞为分散弱阳性，二、免疫

3、细胞化学技术(Immunocytochemistry )利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性，是用已知标记的抗体检测组织和细胞中对应抗原的方法。宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色、宫颈鳞癌细胞的免疫组化染色、NRDRB1蛋白在宫颈鳞癌组织中显示特异表达，茶色为阳性表达。 三、放射自显影技术(autoradiography )放射自显影技术是利用放射性同位素电离辐射对胶乳(包括AgBr或AgCl )的感光作用，对细胞内的生物高分子进行定性、定位和半定量研究的细胞化学技术。 研究标记化合物在生物、组织和细胞中的分布、定位、排放及合成、更新、作用机制、作用部位等。 常用的弱放射性同位素35S、14C、3

4、H等和强放射性同位素32P。 缺点：观察固定细胞内分子的分布情况，与活细胞中的分布有一定的距离。 活细胞内分子追踪技术，四，活细胞内分子追踪技术(一)利用离子探针实时监测细胞内离子的原理：某色素与某离子特异性结合会产生荧光，或改变自身荧光的发光波长和强度，通过荧光测定显示其离子量应用：细胞内离子的实时检测。 (二)绿色荧光蛋白质(GFP )的应用：为了显示特定蛋白质在细胞内的定位，间接研究蛋白质之间的相互作用。 原理：构建荧光蛋白基因和目标蛋白质基因融合基因表达载体，转染特定细胞，用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察目标蛋白质在细胞内的位置和时间变化情况。 特征：融合蛋白质不影响目标蛋白质的正确定位

5、，荧光蛋白质只是一种标记物。 缺点：不能直接为一些蛋白质检测的相互作用提供证据。 其他荧光蛋白质：黄色荧光蛋白质(YGP )、蓝色荧光蛋白质(BGP )、蓝色荧光蛋白质(CGP )，等等，(三)荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET )应用：原理：当荧光体和荧光受体分子接近，施主的发光光谱和受体的激发光谱重叠时，通过偶极子相互作用，能量转移到相邻的受体分子，可以用荧光显微镜观察到一种非放射能迁移。 特征：受体、施主的激发光必须充分分开；施主的发光光谱和受体的激发光谱重叠。 常见的FRET荧光染料Cy3-Cy5； Alexa546-Al

6、exa647； Texas Red-Tetramethylrhodamine等。 (四)单分子示踪单分子荧光成像的优势：样品激发范围小，光子收集效率高，高量子生产能力高信噪比荧光基和低成本荧光。 应用：配体与受体的结合，蛋白质的集合和解释，蛋白质、mRNA等生物高分子的动力学行为和蛋白质，病毒的示踪。 原子力显微镜的优势：在溶液和和室温度下操作，分辨率高，适合在生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。 第五节细胞功能基因组学研究技术，第一，基因表达的定量分析第二，基因表达的上升和下降技术第三，蛋白质相互作用的研究技术第四，蛋白质和核酸的相互作用研究技术第五，生物芯片技术第六，蛋白质组学技术第七

7、，高通量测定序列技术第八， 模式动物个体水平的基因操作技术第一基因表达的定量分析(一)印迹杂交技术定量检测基因表达变化的基本方法Northern blotting检测特异性mRNA的技术、改性处理(甲醛、戊二醛)。 Westen Blotting检测蛋白质分子，检测同一蛋白质的不同修饰方法，如磷酸化、甲基化、泛素化，考察蛋白质含量、大小、活性状态的重要方法。 优点：低成本，结果准确，幻想少。 缺点：低通量的检测技术、步骤复杂、花费时间：(二)原位混合， ISH )基因表达的时空信息的基本原理是利用核酸分子单链间互补的碱基序列，将放射性或非放射性外来核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上的待测DN

8、A或RNA互补配对，结合到特异性的核酸杂交分子上，通过一定的测定手段测定对为了显示特定的核酸序列，组织、细胞或染色体的固定、与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)，有与探针结合的标记物，、u、u、g、g、c、u、g、g、g、a、u、u、u c，c，g，a，c g :，RNA探针，测定对象mRNA，酶标记抗体，标记物，insitu杂交的原理，(3)荧光实时定量PCR (Real-time PCR )的基因表达的测定方法是19 1993年获得诺贝尔化学奖。 Mullis合成了DNA引物进行测序，但却为没有许多模板DNA而烦恼。 1983年4月星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上，突然想到了“聚合酶连锁

9、反应”。 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR ) :在体外反复复制特定DNA序列的反应(放大)。 反应体系：模板DNA耐热DNA聚合酶； 底漆； 4种脱氧核苷酸(dNTP )反应缓冲液。 实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中添加荧光基，积蓄荧光信号并实时监视整个PCR过程，最后使用标准曲线定量分析未知模板的方法。 反应步骤： (1) 95改性： DNA双链解离； (2) 55退火： DNA链与引物互补地结合； (3) 72拉伸：利用DNA聚合酶进行互补链合成。 二、基因表达的上升和下降技术基因克隆：将cDNA克隆，即mRNA逆转录形成的cDNA或体

10、外聚合酶连锁反应得到的基因片段插入可自我复制的载体(通常是质粒)中，在受体细菌内实现大量扩增过程转染(transfection ) :将具有外源基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。 通过表达载体的启动子，外源基因获得over-expression，实现细胞中目的基因表达的提高。 (1)外源基因在细胞中的过表达是提高基因表达的主要方式；(2)RNA干扰技术是降低基因表达的常用方法RNA干扰(RNAi )是通过小干扰RNA (小干扰RNA，siRNA )对目标mRNA的特异性是一种有效、特异地阻断体内特定基因表达，使细胞表达特定基因缺失的表型，基因转录后使其沉默的现象。 三、蛋白质相互作用

11、的研究技术是研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。 (1)免疫沉淀与凝胶粒子和珠粒结合的目的蛋白质的抗体使细胞分裂液和表达上清中的相应蛋白质结合沉淀，在该过程中能与目的蛋白质相互作用的蛋白质同时沉淀，利用SDS-PAGE、免疫印迹和生物量等技术队伍沉淀中的蛋白质进行鉴定。 缺点：无法动态检测，存在假阳性。 应用：验证蛋白质和蛋白质的相互作用。 以酵母双杂交视已知蛋白的cDNA序列作为饵料(bait )，将其与DNA结合区融合构建饵料质粒。 将筛选的蛋白质cDNA序列和转录活性域融合，构建文库质粒。 把这两个质粒转化成酵母细胞。 如果酵母细胞中的诱饵蛋白质能与应该筛选的未知蛋白质特异性地相

12、互作用，就不能激活报告基因的转录。 缺点：只能说明两种蛋白质之间有相互作用的结构基础，这两种蛋白质在细胞内必须相遇，并不表明这种相互作用确实存在于活细胞中，需要用免疫共沉淀法进行验证。(3)吞噬体可以筛选出相互作用的蛋白质的被筛选蛋白cDNA和噬菌体的衣原体DNA构建融合基因，将显示在噬菌体表面表达筛选蛋白质的目的蛋白固定在平板或珠子上， 冲洗展示不同筛选蛋白的噬菌体文库和孵化的未结合噬菌体，分离特异性结合的噬菌体，放大噬菌体，重复上述分离过程，浓缩特异性结合的噬菌体，确定基因序列。 四蛋白质和核酸相互作用的研究技术蛋白质和核酸(DNA和RNA )的相互作用是基因表达调控的基础。 蛋白质和基因

13、组DNA的相互作用完成了基因转录水平的调节、蛋白质(RNA结合蛋白，RBP )和RNA特性结合转录水平和翻译水平的RNA加工、修饰、运输、定位和分解等过程。 (1)染色质免疫沉淀技术DNA和蛋白质相互作用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP )的原理是将细胞内的DNA和蛋白质在生理状态下交联，用超声波或酶处理将染色质切成小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应交联反应的逆转和DNA的纯化，DNA的鉴定。 染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应逆转、DNA纯化和DNA鉴定。 (二)紫外线免疫沉淀研究RNA和RNA

14、结合蛋白的相互作用：在全基因组水平明确RNA和RBP的相互作用。 原理：用254nm紫外光照射使细胞中的RNA分子与RNA结合蛋白共价键，利用RBP的特异性抗体使RNA-蛋白质复合体沉淀后，回收其中的RNA片段，逆转录后对RNA分子进行排序，发现RNA与RBP的相互关系。 反转录识别限制酶切位点和序列的引物可使CLIP的分辨率成为单一碱基水平，即iCLIP。 缺点：架桥效率低，难以区分结合和非结合RNA序列，254nm能诱发细胞DNA损伤，结合新的RBP。改良技术：光活化核糖核苷酸强化的交联免疫沉淀技术(PAR-CLIP )、紫外交联合免疫共沉淀序列(CLIP seq )即紫外交联合免疫沉淀结

15、合高通量测定序列，5、生物芯片技术应用：基因差异表达分析、DNA序列分析， 基因突变和多态性扫描基因组DNA突变和染色体突变的检测原理：用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物高分子，如核酸片段、多肽分子，甚至组织切片、细胞等生物样品有规律地硬化，构成密集的二维分子序列， 与标记的待测生物样品中的目标分子杂交，通过特定仪器迅速、并行、有效地检测分析杂交信号的强度，来判断样品中的目标分子的数量。 根据芯片上固定的生物分子分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。 根据其功能差异，可分为测序芯片、表达芯片、比较基因组杂交(CGH )芯片。 基因芯片(Genechip )也称为DNA芯片，基于

16、核酸杂交原理，将多个探针分子固定在支撑体上，与标记的样品杂交，检测杂交信号的强度和分布来进行分析。 蛋白质芯片利用抗体和抗原的特异性结合，即免疫反应的原理，将蛋白质分子(抗原或抗体)结合到固相支撑体上，从而形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。 六蛋白质组学技术蛋白质组学(proteome ) proteinsexpressedbygenome (基因组表达的所有蛋白质)是指处于特定时空条件下的细胞、组织或器官中包含的所有蛋白质蛋白质组学(proteomics )是一门研究特定时空条件下细胞、组织或器官中包含的所有蛋白质的存在，即其活性方式的学科。 两相电泳技术质谱分析法蛋白质鉴定质谱：电喷雾离子质谱(ESI-MS )，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS )蛋白质的质谱序列：串联质谱(MS/MS )，七， 高通量测量序列技术高通量测量序列技术(High-throughput sequencing )也被称为深度排序，也称为“下一代”排序技术(“下一代”sequenceingtechnolo 高精度、高吞吐量、高灵敏度、低运行成本等优势，可以同时完成传统基因组学的研究(测序和注释)和功能基因组学(基因表达和调控、基因功能、蛋白/核酸相互作用)的研究。 原理：将DNA固定在芯片上，决定序列的反应以大规模陈列姓进行排列，边合成边决