光谱分析技术

1、第一节分光分析技术，学习目标，1 .能说出临床生物化学检查中常用的分析技术名称2 .掌握光的吸收规律，理解吸光系数的意义和应用3 .阐述分光光度技术的定量测定方法4 .火焰光度法、比浊法、原子吸收分光光度法荧光分析法的原理、影响因素和主要应用，是能量的表现形式，也是电磁波的一种光在真空中直线传播，在不同介质上会发生反射、折射、衍射、色散、干涉、偏振等现象。 如果用波长、频率、传播速度等参数来记述，则光具有“波动性”。 光的颜色是由光的波长决定的，人眼感觉到的光称为可见光，其波长在400750nm之间。 可见光以外，红外光7601000nm的紫外光200400nm、光、光谱分析技术是什么？ 光的

2、波长()单位在纳米(nm )的各种化学物质上具有一定的光谱特性，可以选择性地吸收、发射、散射某波长的光。 利用物质的吸收光谱、发光光谱或散射光谱特征对物质进行定性定量分析的技术叫做光谱分析技术。 光谱分析技术的原理：利用各种化学物质具有发光、吸收或散射光谱系的特征，来确定物质的性质、结构或含量。 分光分析技术的分类：发光光谱分析技术：火焰光度法，荧光法吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度法散射光谱分析技术：比浊法，一、分光光度技术的基本原理，很多化学物质有颜色，无颜色的化合物也能与显色剂起作用生成有色物质。 实践证明，有色溶液浓度越大，颜色越浓，浓度越小，颜色越淡。 因此，通过比

3、较溶液颜色的浓淡，决定有色溶液的浓度，可以定量分析溶液中包含的物质。 根据比较色的浓淡定量地分析溶液的方法叫做比色分析法。 光子的能量和波长的关系是E=h=hc/式，e是光子的能量(j :焦耳)，是频率，h是普朗克常数(6.6310-34JS )，c是光速，是光的波长，因此波长不同的光能量不同，短波的能量大，长波的光的显色原理是，如果能以一定的强度比率混合某2色光得到白色光的话，就把这2色光称为补色。 图中处于直线关系的两种光是补色。 绿光和紫光为补色，黄光和蓝光为补色等。 各种溶液显示不同的颜色，因为溶液中的有色点(分子或离子)有选择地吸收某种颜色的光。 实验证明，溶液显示的颜色主要是吸收光

4、的补色。 当一束白色光通过高锰酸钾溶液时，绿色光的大部分被选择性吸收，其他光透过溶液。 从补色的图像可以看出，透射光只剩下紫色的光，所以高锰酸钾溶液呈紫色。 (2)光的吸收规律、溶液颜色的浓淡和浓度的关系可以用吸收规律记述。 是约翰海因里希兰伯特和奥古斯特维尔的组合，被称为兰伯特维尔的法则。 原子吸收光度计也符合这个规律。 溶液对光的吸收强度为I的平行单色光照射到溶液上时，一部分光被溶液吸收，一部分光在界面上散射，剩馀的光透过溶液，如图所示，i0=iaI rii0-入射光强度I a-吸收光强度I r-反射光强度I t-透射光强度通常ir小，所以不能忽视可以简化为I0=I a I t透射光I t

5、和入射光强度I0的相对透射率或透射光度，用t表示： T=I t/I 0透射率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用a表示： A=-lgT=lg1/T=lgI 0/I t，蓝色I，白色光I，0，I，黄色光的透过度和吸光度表示入射光被吸收的程度，它们之间可以根据式换算。 实验证明，单色光通过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，也与溶液的厚度和溶液自身的光吸收性能有关。 其规律可以用A=KCL式表示： A吸光度(或也称为光密度，也可以用d表示)。 K某溶液的消光系数C溶液的浓度L的光路，即溶液的厚度。 Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀的非散射液体。 分光光

6、度计的基本结构，可见光光度计721、721-A、722、723型分光光度计等紫外分光光度计751、752、753型分光光度计等紫外可见光分光光度计贝克曼DU500系列紫外分光光度计，吸光系数式吸光系数a以a=C(g/L).L(cm )单位L/g.cm摩尔吸光系数A 为=C(mol/L).L(cm )单位L/mol.cm摩尔吸光系数A E为E=C(g/dl).L(cm )单位为dL/(g.cm )，摩尔消光系数与百分比衰减系数的换算关系：=E * M (摩尔质量) 10， 1cm，1，机器基本组成，光源，单色器，样品室，检测器，显示，可见分光光度计，722型分光光度计的图像，722型分光光度计的

7、使用方法，(1)预热器将选择开关设为“t”，打开电源开关，对机器进行20分钟的预热。 不要连续照射光，以防止光电管疲劳。 预热和不测量机器时，请打开试料室的盖子，切断光路。 (2)根据实验的要求，转动波长手柄，将选定的波长调整为必要的单色波长。 (3)固定灵敏度范围在能很好地将空白溶液调整为“100%”的情况下，采用尽可能低的范围，使用时首先调整为“1”范围，灵敏度不足的情况下逐渐变高。 但是，偏移改变灵敏度后，有必要重新修正“0%”和“100%”。 选择的灵敏度在实验中不要再变动了。 (调节T=0%，轻轻转动“0%”旋钮，数字显示为“00.0”(此时试料室打开)。 调节(T=100%，将装有

8、蒸馏水(或空白溶液、或纯溶剂)的比色皿放入比色皿支架的第一段中，对准光路，轻轻关闭试料室的盖，调节透过率“100%”的旋钮，使数字正好显示为“100.0”。 (6)在吸光度的测定中，将选择开关设为“a”，盖上试料室的盖，将空白液放在光路中，调节吸光度调节旋钮，将数字表示为“. 000”。 把装有要测量的溶液的比色盘放入比色盘托架中的其他单元，关上试料室的盖，轻拉试料托架的把手，将要测量的溶液放入光路中，数值表示值就是该要测量的溶液的吸光度值。 读取后，打开试料室的盖，切断光路。 重复上述测定操作12次，读取相应的吸光度值，取平均值。 (7)将浓度的测定选择开关从“a”转动到“c”，将测定出的浓

9、度的样品放入光路，调节浓度刻度盘，使数值成为测定值，将测定出的样品放入光路，数值显示值成为该测定对象溶液的浓度值。 (8)关闭实验结束后，关闭电源，取出比色盘清洗，用柔软的纸擦拭比色盘托架。 注意事项是，(1)为了防止光电管的疲劳，不测定时需要打开试料室的盖，切断光路，延长光电管的寿命。 (2)取下比色盘时，手指仅捏着比色盘的毛玻璃面，不能接触到比色盘的光学面。 (3)比色盘不能用碱溶液或氧化性强的清洗液清洗，也不能用毛刷清洗。 附着在比色盘外壁的水和溶液，请不要用镜纸或细软的吸水纸吸取，以免损伤其光学表面。 一、标准曲线法顺序： (1)首先调制5种以上标准浓度的溶液。 (2)测定每个溶液的吸

10、光度a。(3)ac的标准图表如图所示。 如果有标准的工作曲线的话，就可以测定溶液。 在相同条件下用机器测定a时，调查标准曲线得到了被测溶液的浓度值Cx。 A-C曲线的数学式： y=ax b y :吸光度x :浓度a :斜率b :切片、分光光度技术的定量方法、制作标准曲线并应用时，请注意以下几点：(1)测定条件变化时(例如，更换标准品和试剂时等)，请重新绘制。 (2)标准品要求高纯度，标准液的配制必须正确。 (3)测定对象液的吸光度超过线性范围时，稀释样品后进行测定。 (4)标本测定的条件必须与标准曲线制作时的条件完全一致。 2、比较法(标准对照法)、已知浓度的标准品和标本进行同样的处理，使用相

11、同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度和标准品浓度，可以直接计算标本的浓度，计算式为： Cu=(AuCs)/As中，Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为使用标准品法定量时，标准品的浓度应尽可能接近标本管的浓度。 火焰光度法、Na、k测定可以采用火焰光度法。 原理：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回到基态时发射的光谱强度分析其含量。 火焰光度法定量关系I=a c式中，I -特征光谱强度； c -测定对象物浓度a -元素的激发电位、温度及样品成分相关的参数以火焰作为激发光源的情况下，燃烧稳定，在火焰中成分的分散度良好，因此，此时a为常数，b -自吸

12、引状况参数，c低的情况下，b=1。 此时，自吸现象可忽略，I=a c该方法可检测血清、尿、脑脊液和胸腹水的Na和k，该方法属于经典的标准法，优点：结果正确，广泛采用临床医学教育“育网收集整理”。 通常采用的定量法是标准曲线法、标准加入法、内标准法。 内标准法：标本和标准液加入相同浓度的内标准元素测定，一般加入锂内标准元素，测定锂/钠或锂/钾电流之比，不仅能减小钠或钾的电流，还能减小气体和火焰的温度变动等因素引起的误差属于b、比浊分析法、比浊分析法(浊度法)、散射光谱分析。 原理：光通过混浊的介质溶液时，由于溶液中存在浑浊的粒子，光被部分吸收，吸收的量与混浊的粒子的量成正比。 这种光吸收量的测定

13、方法被称为比浊分析法的临床应用：最多的是免疫比浊法利用抗原抗体的特异性结合形成复合体，通过测定复合体形成量的多少来定量抗原抗体的方法。 特征： (1)需要特异性抗体(2)抗原抗体的比例，(3)溶液介质的PH、离子强度等很合适。 影响因素：1.悬浊液的散射光强度主要与粒子数有关2 .注意掌握反应温度。 溶液的PH值影响沉淀的形成和粒子的大小4 .悬浊液的稳定性差，立即浑浊5 .稀释缓冲液中的电解质和非电解质影响免疫复合物的形成和稳定性6 .适当选择滤波器和入射光波长，原子吸收分光光度法原理：也称为原子吸收光度法，对蒸汽相中的测定对象元素的基态原子的共振放射这是测定微量元素和超微量元素的有效方法。

14、 特征：具有灵敏度高、噪声少、选择性好、操作简单、快速、结果准确、可靠性高、应用范围广、设备比较简单、价格便宜等优点，且能使操作整体自动化，因此近年来应用了发展迅速、广泛的设备分析新技术。方法：在温度吸收光路、样品方式等实验条件一定的情况下，样品产生的待测元素相基态原子吸收作为尖锐线光源的该元素空心阴极灯发射的单色光，其吸光度(a )与样品中该元素的浓度(c )成比例。 即，在A=KC公式中，k是常数。 由此，通过测定标准溶液和未知溶液的吸光度，可以知道标准溶液的浓度，制作标准曲线，可以求出未知液中的测定对象元素的浓度。 应用：主要应用样品中微量及微量成分分析。 荧光分析法，定义：一种利用反映某物质被紫外光照射后产生的该物质特性的荧光，进行定性或定量分析的方法。 原理：物质分子吸收紫外光和可见光后，从电子基态能级向激发态能级转变。 处于激发态的分子不稳定，通过各种方法失去能量，回到基态。 分子首先通过碰撞和系统内变换等方法失去能量的一部分，下降到电子第一激发态的最低振动能级后，发射一定波长的光回到电子基态的任一振动能级，发射出的光称为荧光。 显然，荧光的能量比激发光的能量小，波长比激发光长。 荧光的平均寿命短，除了激发光源外，荧光很快就会消失。 特征：灵敏度更高选择性更强，使用方便，课