帕金森病课件

1、帕金森病,掌握内容 1.概念：帕金森病；基因修饰细胞 2.帕金森病的病理表现及发病的病理学基础 3.基底神经节环路的调节方式 4.帕金森病的发病机制,2,PPT学习交流,一、定义,帕金森病（Pakinsons Disease, PD）又名震颤麻痹（paralysis agitans），由Parkinson（1817）首先描述，是一种进展缓慢，原发于黑质-纹状体通路的锥体外系变性疾病。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要特征。,3,PPT学习交流,临床表现 肢体震颤 肌强直 运动迟缓 姿势平衡反射消失 其他症状,Monograph by James Parkinson 181

2、7,4,PPT学习交流,流行病学,PD在60岁以上人群中患病率为1000/10万，并随年龄增长而增高，两性分布差异不大 是一种常见的中老年人神经系统变性疾病,5,PPT学习交流,病理,主要病理改变是含色素的黑质致密部DA能神经元变性、缺失 出现症状时DA能神经元常丢失50%以上，症状明显时神经元丢失严重，残留者变性，黑色素减少 以黑质、纹状体减少为主，皮层和下丘脑并不减少,6,PPT学习交流,病理改变,7,PPT学习交流,PET显示PD脑内DAT功能显著降低,8,PPT学习交流,病理,胞浆内出现特征性嗜酸性包涵体-Lewy小体，a-突触核蛋白是Lewy小体中重要成分 类似改变也见于蓝斑、中缝核

3、、迷走神经背核等，程度较轻,9,PPT学习交流,病理特点,总之，典型病理特点是： 进行性黑质含色素多巴胺神经元大量丧失(50%70%) 路易(Lewy)小体有a-突触核蛋白沉积,10,PPT学习交流,病理改变,a. 黑质萎缩 b. 与正常对照比较,Parkinson病 a.黑质致密部Lewy体，H&E b.改良Bielschowsky银染技术,11,PPT学习交流,生化病理,脑内存在多条DA递质通路，最重要为黑质-纹状体通路 左旋酪氨酸 TH L-DOPA DDC DA 该通路DA神经元在黑质致密部，正常时自血流摄入左旋酪氨酸，经细胞内酪氨酸羟化酶(TH)转化为左旋多巴(L-DOPA) 再经过

4、多巴脱羧酶(DDC)转化为DA DA通过黑质-纹状体束作用于壳核和尾状核细胞,12,PPT学习交流,Levodopa Mechanism,13,PPT学习交流,黑质-纹状体多巴胺系统功能紊乱，多巴胺含量显著减少(80% 99%) 该生化异常与临床症状严重程度成正比 PD发病的病理学基础：黑质-纹状体多巴胺能神经环路,14,PPT学习交流,生化病理-基底节的神经生化解剖简图,DA神经元对纹状体GABA源性递质释放起抑制作用,ACh神经元对纹状体GABA源性递质释放起兴奋作用,15,PPT学习交流,生化病理-帕金森病基底节神经生化病理学,DA神经元变性(黑圈及虚线)破坏纹状体GABA神经元的多巴胺

5、抑制与ACh兴奋的平衡 净效应是增加纹状体GABA释放,16,PPT学习交流,帕金森病生化病理,17,PPT学习交流,病因及发病机制,本病病因迄今未明-原发性PD (idiopathic Parkinsons disease)。 发病确切机制还不完全清楚，20世纪80年代以后，对PD发病机制的研究有两个突破性发展：其一基底核神经回路的平衡失调成为PD发病的病理基础；其二DA氧化应激学说成为黑质部位DA神经元退化的理论基础。,18,PPT学习交流,一、基底神经节环路与帕金森病 锥体外系的运动调节中心区：基底神经节 运动调节的关键递质：多巴胺 基底神经节（basal ganglia）包括：纹状体

6、（striaturn, corpus striaturn）、黑质 （substantia nigra, SN）、丘脑底核和杏仁核。,19,PPT学习交流,基底神经节的主要功能：控制肢体肌张力，全身运动协调，维持姿势调节反射和下运动神经元的反射控制 基底神经节损害：肌张力不全运动增多综合征或肌张力增高运动减少综合征,20,PPT学习交流,基底神经节接受来自大脑皮层有关运动区的传入冲动，基底神经节的传出冲动又通过丘脑返回皮质的特定区域，构成了5条不同通路的皮质-基底节-丘脑-皮质反馈的神经环路。 基底神经节环路的调节方式：直接通路；间接通路；黑质-纹状体多巴胺通路。,基底核调节运动的神经回路,22

7、,PPT学习交流,（一）直接通路 皮层谷氨酸能神经元 纹状体GABA神经元释放GABA递质 苍白球GABA神经元 丘脑对谷氨酸神经元抑制作用 谷氨酸释放增加 皮层运动神经元活性增加。 （二）间接通路 皮层谷氨酸能神经元 纹状体GABA神经元释放 GABA递质 苍白球GABA神经元 丘脑底核的谷氨酸能神经元纤维投射到苍白球的神经兴奋性 苍白球的GABA神经元释放增加 丘脑谷氨酸能神经元兴奋性降低 皮层运动,兴奋,抑制,减弱,兴奋,抑制,抑制,23,PPT学习交流,（三）黑质-纹状体多巴胺通路 直接环路：D1受体介导的，GABA/肽类神经 递质(SP)/强啡肽(DYN)参与的调 节环路，起兴奋调节

8、效应 。 间接环路：D2受体介导的，GABA/脑啡肽 (ENK)/神经营养素(NT)参与的调 节环路，起去抑制调节效应。 二者易化运动效果，相互协调作用，平衡锥体外系运动功能。,24,PPT学习交流,T,Dopamine: Inhibitory Ach: Excitatory GABA: Inhibitory,DA neuron generated,三、PD的发病机制 （一）环境因素与PD发病 参与PD发病的物质： （1）N-甲基氨基-L-丙氨酸（L-BMMA ） （2）长期接触铜、锰、铁、铅或长期暴露 于杀虫剂 （3）N-甲基1,2,3,6四氢吡啶（N-methyl- 4-phenyl-1,

9、2,3,6-tet-rahydro-pyridine， MPTP ）,26,PPT学习交流,（二）多巴胺(DA)的氧化应激学说与 PD发病 脑内生成的自由基可以攻击脑内的多巴胺神经元，使之产生神经细胞的退化性病理变化。 氧化应激损伤是黑质多巴胺神经元死亡的主要原因，导致氧化应激损伤增高的可能原因：外源性毒物的侵入；DA的氧化应激代谢；神经黑色素的存在；清除自由基的能力不全。,27,PPT学习交流,1、DA的氧化应激代谢 在DA的代谢过程中，77%DA被星形神经胶质细胞内的单氨氧化酶B( MAO-B )所氧化，23%DA被神经元内MAO-A氧化代谢。在O2存在的情况下，此MAO-A催化DA代谢为

10、34-双羟苯乙酸（DOPAC）的同时生成过氧化氢（H2O2），DOPAC在单胺氧化酶甲基转移酶的作用下代谢生成高香草酸（HVA）。 在生理的条件下，DA的酶促反应代谢较快。但在氧化应激的条件下，神经细胞内的DA可通过非酶促反应来进行代谢，在铁离子的参与下，反应加快，被氧化生成醌类衍化物，并进一步形成黑色素。,28,PPT学习交流,多巴胺在神经元中的酶代谢及其代谢产物,29,PPT学习交流,在DA代谢过程中，产生超氧阴离子（O2-）和H2O2；此外，多巴胺又可以被代谢形成6-羟基多巴（6-hydroxyldopamine, 6-OHDA），后者又可以作为单胺类神经递质的化学切割剂进一步损伤多巴胺

11、神经元。 该途经生成的H2O2通过Fenton反映，形成羟基和羟自由基。 H2O2 + Fe3+ OH - + OH,30,PPT学习交流,2、铁离子参与DA的氧化应激 脑内的铁离子（Fe2+和Fe3+）主要分布在黑质、纹状体和苍白球，尤其是在黑质。在PD病人的脑内发现铁离子的含量明显升高，并呈现以下三方面的特点： 在黑质的铁离子浓度异常升高，但其它脑区并 不升高； 铁离子含量升高，但铁蛋白的含量不变； Fe3+含量升高，但Fe2+的含量不变。 这些特点提示黑质铁离子的升高可能与PD的发病过程有关。,31,PPT学习交流,铁离子的促进氧化应激的作用可以通过以下几条途径： 如前所述，加速非酶促反

12、应的DA自身氧 化生成H2O2和O2-。 促进H2O2和O2-形成OH。 促使脂质过氧化物的分解。 铁离子与黑色素结合沉积于黑质，催化 自由基产生。,DA神经毒的氧化应激机制示意图,33,PPT学习交流,由上述可以得出多巴胺引起儿茶酚胺的细胞死亡主要通过以下三方面的机制： 细胞内和细胞外的多巴胺的自身氧化产生 自由基； MAO介导的多巴胺代谢产生的过氧化氢； 多巴胺对线粒体呼吸链的直接抑制作用。,（三）遗传易感性 参与PD发病的遗传调节因子： 1、-神经突触核蛋白(-synuclein, -SN) ： 除分布在神经突触末梢外，在神经细胞核内也有分布，因此称为神经突触核蛋白，可分为、和三种 。

13、有几个PD家系的患者-SN有突变位点，主要位于染色体臂的4q21-q23，呈染色体显性遗传。 -SN致蛋白空间结构改变，可引起DA神经元选择性毁损，且需要达到一定量才会发生作用。 在MPTP制备的PD模型上观察到，黒质神经元 上-SN表达呈时间依赖性上调，并与DA神 经元退变平行。,35,PPT学习交流,2、Parkin ：parkin基因突变与早发性PD有关。Parkin主要位于神经元胞浆和突触中，与突触传递有关，功能与泛素样蛋白裂解有关，参与泛素蛋白酶体复合物降解异常蛋白的功能，若此复合物的功能减退，则导致异常蛋白选择性聚集在黒质多巴胺神经元，妨碍多巴胺递质释放和运输，产生PD样症状，同时

14、产生细胞毒性，导致细胞死亡。,36,PPT学习交流,3、细胞色素P450同工酶 ：能代谢很多内外源性物质。 亚家族CYP 2D6 可能与PD发病有关；在肝脏MPTP通过 CYP 2D6的代谢形成非毒性产物，而在脑中则经MAO-B代谢形成有毒性的产物MPP+。如果细胞色素P450酶基因和阿朴脂蛋白E同时改变时，则诱导PD的发病的可能性加大。,（四）线粒体功能缺陷 MPTP 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+) 动物（特别是灵长类动物）产生类似PD的病理及临床特点 机制：阻断线粒体呼吸链复合物I （五）兴奋性氨基酸的毒性作用 兴奋性氨基酸L-谷氨酸与PD的发病有关 ，主要通过N-甲基-D天冬氨酸

15、(NMDA)起作用。,MAO-B,诱发,38,PPT学习交流,主要机制： 老龄动物神经突触线粒体内膜上的谷氨酸载体的转运活性明显 谷氨酸和天冬氨酸的线粒体的内外交换发生障碍 谷氨酸在细胞内大量堆积，同时神经细胞间隙的谷氨酸不能及时地被再摄取，引起NMDA型谷氨酸受体持久性激活 （1）改变Ca2+、Na+、Cl-等离子的通透性 ，破坏细 胞的生理稳态平衡，使细胞肿胀、变性和坏死 ； （2）诱发线粒体内自由基的生成 ； （3）引起线粒体肿胀和功能异常 。 黑质变性 PD,39,PPT学习交流,（六）其他 1、炎症反应参与PD发病过程 PD病人和长期暴露于MPTP的黑质和纹状体有胶质增生和反应性小胶

16、质细胞；在PD的黑质中已经观察到有胶质细胞表达的白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等炎症反应介质。 2、细胞凋亡与PD发病 细胞凋亡参与神经细胞的发育和老化的生理和病理过程，尚无明确的证据说明凋亡是否参与PD的发病，有些现象提示凋亡可能参与PD的发 病。,40,PPT学习交流,有研究表明，MPP+ 可诱导细胞内凋亡，而细胞凋亡因子Caspase抑制可降低MPTP的神经毒性 。 3、免疫异常与PD发病 PD患者的血清对大鼠中脑DA神经元有抑制作用，并呈补体依赖性的抑制效应。PD患者中多数的病人脑脊液中含有能与黒质多巴胺神经元起免疫反应的抗体，即多巴胺神经元抗体 ；进一步的研究发现，PD患者中有78的病

17、人脑脊液中含有多巴胺神经元抗体，而对照组病人的脑脊液中仅有3的人含有多巴胺神经元抗体。,主要临床表现,主要症状 静止性震颤 肌强直 运动迟缓 姿势步态异常 初发症状：震颤最多(60%70%)，步行障碍(12%)、肌强直(10%)、运动迟缓(10%),42,PPT学习交流,帕金森震颤,多数患者以震颤为首发症状。一侧上肢远端(手指)开始，逐渐扩展到同侧下肢及对侧肢体，下颌、唇、舌及头部最后受累。 静止性震颤，46次/秒。拇指与食指“搓丸样”(pill-rolling)动作，安静时出现。 多为不对称性。 情绪激动或精神紧张时加剧，睡眠中可完全消失。,43,PPT学习交流,肌强直,初期患者感到患肢运动

18、不灵活，有僵硬或紧张的感觉，出现动作困难。 对侧肢体的自主运动可诱导出肌张力的增高。 “铅管样强直”、“齿轮样强直”。,44,PPT学习交流,运动迟缓,因肌张力增高、姿势反射障碍，使起床、翻身、步行、变换方向等运动迟缓 病人有运动启动困难和动作执行困难，是病人最常见和较特殊的表现。 早期以肢体远端受累 对左旋多巴治疗反应好,45,PPT学习交流,运动迟缓的具体表现,一般性表现： 动作启动困难 自主动作变慢、幅度变小 重复动作易疲劳 做序列性动作困难 不能同时做多个动作 僵住,特殊表现： 解系鞋带、扣纽扣难 “小写症” “面具脸” 手摆动减少 流涎 言语减少，语音低沉、单调。,46,PPT学习交

19、流,运动迟缓(bradykinesia),表情肌活动少，双眼凝视，瞬目减少，呈面具脸(masked face)，流涎,47,PPT学习交流,手指精细动作(扣纽、系鞋带等)困难；做序列性动作困难，不能同时做多个动作 随意动作减少，始动困难,48,PPT学习交流,小写症(micrographia),49,PPT学习交流,姿势步态异常,站-屈曲体姿 行-步态异常 转弯-平衡障碍 早期下肢拖曳；之后小步态、启动困难、行走时上肢摆动消失,50,PPT学习交流,屈曲体姿,51,PPT学习交流,四、PD的诊断和治疗,诊断标准 1.静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势性反射障碍；四个症状和体征中的二个。 2.排

20、除帕金森综合征 没有可以引起继发性帕金森病的病因： 如脑外伤、脑血管疾病、病毒感染、金属中毒、一氧化碳中毒等。 3.必要时可结合左旋多巴实验或阿朴吗啡实验。,52,PPT学习交流,修订的帕金森病诊断标准： 有下列表现三项以上的可以诊断： 1. 起病：一个或多个肢体的运动缓慢、静止性 震颤。 2. 明显的单侧分布起病形式。 3. 铅管样或齿轮样强直，伴有面部、躯干或肢体的运动减少，姿势反射异常等。 4. L-DOPA治疗两个月内反应良好（改善25%以上）。 左旋多巴可以改善临床症状，降低死亡率，是治疗PD的金标准,53,PPT学习交流,不支持PD诊断的症状和体征： 1. 下运动神经元损害。 2.

21、 失用性步态障碍。 3. 小脑症状、意向性震颤。 4. 凝视麻痹。 5. 明显的痴呆伴轻度锥体外系症状。 6. 严重的自主神经功能障碍。,（二）PD的治疗 1、 药物治疗 药物治疗是目前最常用的方法，主要针对增加多巴胺递质而改善症状： （1）左旋多巴：是数十年来最主要的治疗药物 ； （2）单胺氧化酶B（monoamine oxidase B, MAO-B）：抑制多巴胺的代谢； （3）多巴胺受体激动药：激活纹状体神经元上的 D1和D2多巴胺受体，增加多巴胺含量 ； （4）乙酰胆碱抑制药。,55,PPT学习交流,2、其他正在进行临床试验的新疗法 （1）多巴胺能组织移植 （2）多巴胺和去甲肾上腺素的

22、微球体注入纹 状体内，能可控地释放多巴胺 ； （3）神经营养因子（neurotrophic factors, NTFs）的治疗 A:胶质源性神经营养因子（GDNF） B:脑源性神经营养因子（BDNF）,56,PPT学习交流,GDNF和BDNF能提高多巴胺能神经元的生存能力，减少MPTP和6-羟多巴对黑质纹状体系统的损害，改善6-羟多巴所致的旋转症状。 C:碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 能提高多巴胺合成酶-酪氨酸羟化酶(TH)免疫活性细胞的数目及活性。 将神经营养因子注入到黑质、纹状体或脑室内可以挽救PD患者的多巴胺能神经元，减轻黑质纹状体系统损害产生的震颤麻痹症状。,57,PPT学习交

23、流,3、基因治疗 PD的基因治疗策略： （1）导入编码多巴胺合成酶的基因以增加多巴 胺局部含量； （2）将神经营养因子基因引入到黑质和纹状体 以阻止或减缓多巴胺能神经元的退变，甚 至促进损伤神经元的恢复。 基因导入的方式 ： （1）直接体内(in vivo)导入:载体 （2）间接体内(ex vivo)导入:细胞,58,PPT学习交流,3.1 基因转移的载体，用于直接体内的表达载体,59,PPT学习交流,3.2 用于间接体内的基因修饰细胞 基因修饰细胞：将外源基因克隆到一个合适的载体并导入体外培养的自体或异体靶细胞内，这种细胞即是基因修饰细胞。 表达载体：真核表达质粒和反转录病毒 靶细胞：神经元

24、前体细胞、原代神经元、神经胶质细胞、成纤维细胞和成肌细胞等。,60,PPT学习交流,3.3 神经递质替代的基因治疗 将编码合成多巴胺的酪氨酸羟化酶( tyroxine hydroxylase，TH ) 和其他与多巴胺合成相关的酶基因引入纹状体，是目前基因治疗PD的主要策略 。 直接体内酶替代基因治疗 A: 将携带TH基因的HSV-1扩增子载体或AAV载体注射到脑内，促进多巴胺合成； B: AAV同时介导TH和GTPCH-I/ADCC基因进 入纹状体内，增加多巴胺含量 ； C: 编码D2受体的腺病毒载体进入大鼠纹状体， 增加D2受体的表达。,61,PPT学习交流, 间接体内酶替代基因治疗 间接体

25、内方法通常先用磷酸钙转染或病毒感染的方法对靶细胞进行基因修饰，再将携带目的基因的细胞植人脑内以达到治疗目的。 移植基因修饰细胞的治疗效果明显，但转移基因细胞的表达呈进行性下降，因此，长期表达是需要解决的问题。,62,PPT学习交流,3.4 神经营养因子的基因治疗 神经营养因子的在PD中的作用： A: 能维持多巴胺能神经元的存活； B: 促进突起生长； C: 增强多巴胺神经元对多巴胺的摄取能力； D: 减轻或防止多巴胺能神经元的损伤，减轻 PD症状。,63,PPT学习交流, 直接体内神经营养因子基因治疗 载体：Ad、AAV、HSV-1和慢病毒等病毒载体 神经营养因子：最主要的是GDNF GDNF

26、作用：防止多巴胺神经元的破坏，对黑质多巴胺能系统产生保护和修复作用，减轻PD症状。 间接体内神经营养因子基因治疗 GDNF, BDNF, bFGF 成纤维细胞、成肌细胞、星型胶质细胞 基因修饰细胞 黑质或纹状体 分泌神经营养因子 减轻PD症状,反转录病毒载体,64,PPT学习交流,五、用于PD研究的动物模型 （一）帕金森病动物模型的发展： 19世纪50年代，Carlson，腹腔内注射利血平后，表现出了类似人类帕金森病的症状。但是该模型不同个体间差别较大，而且其病理改变与人类PD大不相同。 1968，6-OHDA 80年代初期，MPTP,65,PPT学习交流,（二）利用6-羟多巴（6-OHDA）

27、制备的 大鼠PD模型 1. 6-OHDA的建模机制： (1) 黑质内的6-OHDA与DA竞争摄取位点； (2) 细胞内外的氧化反应把6-OHDA分解后产生活性氧，通过MAO诱导产生H2O2； (3) 直接引起线粒体功能障碍。,2. 6-OHDA制模的方法： 完全损伤模型 ：用成年健康SD大鼠或Wistar大鼠麻醉后，固定于立体定位仪，将6-OHDA定向注射于大鼠的内侧前脑束（Medial Forebrain Bundle, MFB）或黑质。 模型成功标准：模型制备成功后，外周注射DA能受体直接激动剂（如阿普吗啡、左旋多巴等）能诱发动物向健侧旋转，促DA释放剂如苯丙胺等能诱发动物向损伤侧旋转。,

28、67,PPT学习交流, 部分损伤模型 ： A: 小剂量6-OHDA黑质内注射； B: 黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）周围注射，外侧单点注射和内外侧两点注射； C: 纹状体内注射。,68,PPT学习交流,3. 6-OHDA模型的行为测定与评定： 大鼠PD模型制备成功的标准：注入诱导剂后，通过旋转测量仪计算30分钟内大鼠旋转的总次数，若超过平均7转/分钟，连续4周诱发旋转次数稳定，表示损毁稳定，可认为模型制备成功。 完全损伤模型 ：可模拟晚期帕金森病病人的特征，主要用于黑质细胞移植，TH基因及胶质源性神经营养因子移植等研究。 6-OHDA单侧损

29、毁模型 ：用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗和神经保护治疗等方面的研究。,69,PPT学习交流,（三）利用MPTP制作的帕金森病动物模型 1. MPTP制模的方法 . 非人灵长类动物双侧PD模型； . 非人灵长类动物偏侧PD模型； . 小鼠PD模型； . 猫的PD模型。,70,PPT学习交流,2. MPTP的制模机制：MPTP 主要通过MPP+ 发挥作用 （1）抑制线粒体的呼吸功能； （2）产生氧自由基和改变Ca2+流； 使黑质神经元细胞减少。 （3）低浓度的MPP+能诱发黑质细胞发生凋 亡，而高浓度的MPP+则导致细胞死亡。,71,PPT学习交流,3. MPTP模型的行为测定与评价： . 非人灵长类双侧PD动物模型： 较少用 . 非人灵长类偏侧PD动物模型：是目前建立 机制、诊断和治疗等方面的研究。 . 猫PD模型： 在PD基础和临床药理研究方 面具有很好的应用价值。 . 小鼠MPTP模型：主要用于检测药物毒性机 制等实验，一般不进行行为测定。,72,PPT学习交流,（四）利用其它药物和方法制作的PD动物模型： 1. 遗传学模型：-神经突触核蛋白基因和 Parkin基因PD动物模型。 2.免疫损伤模型：将PD患者血清免疫球蛋白 或免疫激活剂