纤维素酶ppt课件

1、.,作者：刘洋,纤维素酶的发酵,.,引言,纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。据估计，地球纤维素每年通过光合作用的更新量约为4.0X 1010吨。 纤维素是地球上最丰富的多糖物质，是植物细胞壁的主要组分，占植物秸秆干重的l3l2，也是自然界存在的最多的一类可再生生物聚合物。 依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素为一种具有巨大潜力的。,.,全世界农作物秸秆年产量超过20亿吨，仅我国每年秸秆产量就高达7亿吨。由于其中含有大量的纤维素，营养价值低，难以被畜禽利用，因此只有很少一部分用作饲料，少量用来过腹还田或直接还田嘲，而大约有4547作为燃料补充农

2、村能源不足，15以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直接利用率较低，如不对这类纤维素废物加以有效地利用，不仅会严重污染环境，而且也造成资源的极大浪费，因此探索纤维素类废弃物的处理措施，对其进行有效利用是21世纪的重大课题。,引言,.,纤维素的结构,.,什么是纤维素酶？,纤维素酶：纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用,是多组分酶体系，是具有纤维素降解能力酶的总称。 按照纤维素降解微生物和纤维素酶系之间的关系，可将纤维素酶系分为三类： 一是对天然纤维素的降解能力比较弱，但可大量合成分泌到胞外的纤维素降解酶系，酶的组分是游离的，如常见的木霉、青霉的纤维素酶系； 二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到

3、胞外的纤维素酶系活力较低，如担子菌类等； 三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶分泌到胞外，如厌氧细菌的纤维素酶系。,.,纤维素酶的组成及性质,1：外切葡聚糖酶包括两类酶， 一类：是-1，4-D-葡聚糖一葡萄糖水解酶，也称为纤维素糊精酶(Ec3.2.1.74)； 二类：酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases CBH)，即-1，4-D-葡聚糖一纤维二糖水解酶(exo-B-1，4-D-glucanases，EC3.2.1.91)，简称外切酶。CBH是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维素，作用于无定形纤维素的非

4、还原末端或还原端，水解-1，4一糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。,.,2:内切纤维素酶(endoglueanases，EG)或内切葡聚糖酶，即内切1，4-D-葡聚糖q一葡聚糖水解酶(endo-glucanasea，EC3.2.1.4)，简称内切酶，也称cx酶，CMC酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素的非定形区，无规则水解-1，4糖苷键，形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不同大小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的末端。,纤维素酶的组成及性质,.,3：-葡萄糖苷酶(-glucosidases，-6或BG)或-D-葡萄糖苷一

5、葡萄糖水解(EC3.2.1.21)，又称纤维二糖酶(cellobiase，CB)，它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡萄糖产物。它的水解速率随底物大小的降低而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快咖。严格地讲，-葡萄糖苷酶不能算作纤维素酶，但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用。,纤维素酶的组成及性质,.,纤维素酶理化特性,一：分子量 不同来源、不同组分的纤维素酶分子量差别较大，其变化范围很广。 目前普遍认为： 1.内切酶分子量介于23146kDa；（但有研究认为）内切酶相对分子量介于23118kDa(胞内酶)和4776kDa(胞外酶)。 2.真菌EG的两

6、种异构酶，EGI的分子量约为54kDaEG的分子量约为49.8kDa。 3.外切酶分子量介于38118kDa，木霉属真菌产的CBH 1分子量约为66kDa，CBHII的分子量为53kDa；13葡萄糖苷酶为90l00kDa(胞内酶型)和4776kDa(胞外酶型)。,.,纤维素酶理化特性,二：等电点 等电点(pI)是蛋白质分子的重要理化特征。纤维素酶系中各组分的等电点随菌种来源、培养条件的变化而异。 一般认为，木霉属真菌产的CBHI的pI值约为4.2，CBHII的pI值约为5.9。真菌EGI的pI值约为4.7，EGUI的pI值为4.85.6(也有报道约为7.47)，BG的pI值约为7.58.5。,

7、.,纤维素酶理化特性,三：最适温度 酶反应存在一个最适温度。一般纤维素酶的最适温度范围为4060。纤维素酶各组分热稳定性也存在差异，内切酶(Cx)的最适温度为5060，热稳定性好，在95时仍保留一般的酶活性；不同来源的葡萄糖苷酶的最适温度均为5060 。然而有研究报道，葡萄糖苷酶具有很高的耐温性，在50保温60h，仍保持95%以上的活性，最适温度为70。也有报道，康宁木霉中的外切酶(C1)具有特殊的热稳定性，其最适温度为4060。,.,纤维素酶理化特性,四：纤维素酶的最适ph值 纤维素酶酶活对环境pH值很敏感，不同菌种、不同组分的纤维素酶最适pH值有差异。如曲霉、青霉及木霉产生的酸性纤维素酶，

8、一般在酸性环境pH4.05.0有较高活性。田新玉从200余株嗜碱细菌中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株N6227，其酶反应的最适pH值为8.5。内切酶(cx)的最适pH值为5.07.0；C1酶和BG最适pH值为5.0左右，BG在pH值4.08.0时稳定。,.,纤维素酶理化特性,五：纤维素酶的多样性 产纤维素酶微生物一般不会只有一类纤维素酶组分。试验证明，S.pulverhlentum培养液就包括五种内切葡聚糖酶和两种不同的BG。T. emersonii的胞外酶包括三种BG、四种cx和五种外切酶。即使只产生一类纤维素酶组分，也往往有多种不同的形式。ElenaS等报道，一种白热担子菌(phanero

9、chaete chrysosporium)依靠碳源，能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种不同的BG，其相应的相对分子量分别为96kDa、98kDa和114kna。同一微生物，也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别，这也是纤维素酶多样性的表现。,.,纤维素酶理化特性,六：纤维素酶的诱导性 真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产生。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维素衍生物、一些低聚糖类以及某些单糖和二糖均可作为纤维素的诱导物。Nisizawa研究发现，纤维素、纤维二糖、槐糖、纤维索衍生物等都能诱导里氏木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意的是，纤维二糖、葡萄糖

10、等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用，而较高浓度时便开始抑制。当然，对于不同微生物来说，同一浓度、同一物质也可能有着不同甚至完全相反的作用。,.,纤维素酶的作用原理,纤维素酶降解纤维素的部位优先发生在无定形区的理论已得到普遍认可。 这种理论认为，首先内切型纤维素酶作用于纤维素分子内部的无定形区，随即水解-1，4-糖苷键，将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分予纤维素，随后外切型纤维素酶，又称纤维二糖水解酶，作用于纤维素线状分子末端，水解-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。,.,.,纤维素酶的发酵工艺,纤维素酶的分布非常广泛，主要有三个

11、来源： 1微生物来源：主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物。真菌中活力较高的是木霉、黑曲、青霉和根霉等，细菌中有纤维杆菌、球形生孢纤维粘菌等，目前研究较多的是绿色木霉和纤维杆菌； 2是动物性来源：利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的粗酶制剂； 3生物工程来源：迄今，人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶基因，并构建了这些酶的基因文库。同时，利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造，使其活性提高，耐受性增强。,.,培养基,选择培养基以羧甲基纤维素钠( CMC-Na) 取代查氏培养基中的蔗糖， 其余配方不变； 种子培养基为 0.7 5 CMC - Na ,0 . 5 蛋白

12、胨， 2吐温 8 0， 0 .0 3 MgSO4 、 CaCl2 ， H2O，微量 FeSO4 ,MnSO4 , ZnSO4 ,CoCI2 ， 自然 p H； 发酵培养基为 0 .7 5 CMC - N a ， ( NH4)2SO4 ，2 吐温 8 0 ， 其余同种子培养基,.,方法,1. 刚果红染色法 菌落长成后， 往选择平板中加入适量 110 - 3gmL的刚果红溶液， 染色 l h；弃去染液， 加入适量 lmo l/L的NaCI 溶液， 洗涤 1 h 菌体若能分泌纤维素酶， 则在菌落周围会出现清晰的透明 水解圈， 依据透明圈与菌落直径比值的大小选择产酶菌株 2 .还原糖的测定 采用 3

13、， 5 二硝基水杨酸法( DNS法) ,.,方法,3 .滤纸酶( FPase ) 活性测定：试管底部预先放置适当大小的滤纸( 约 5 0 mg ) ， 加入1mL样品与 1.5 mL柠檬酸一 Na 2 HP O4 缓冲液( 0. 2 mo l L， p H5 . 0 )， 50保温 1 h，扣除本底,测定反应后还原糖的含量 酶活定义为上述条件下， 每小时催化生成 lg葡萄糖的酶量为一个 U ,.,菌种选育,采集到的土壤样本经无菌水洗涤后， 吸取上清液梯度稀释，选取适当浓度涂布选择培养基，挑选出几 株菌， 纯化保藏 用刚果红染色法在选择培养基中复筛， 挑选出4株有较强纤维素水解能力的菌株， 液体

14、培 养基中发酵， 测其纤维素酶的活性， 选择其中酶活性最高的一株保藏备用。,.,发酵过程,.,纤维素酶的发酵工艺,一:固体发酵工艺 1 固体发酵工艺特点: 固体发酵法又称麸曲培养法，是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲后装入盘或帘子上，摊成薄层(厚约1 cm)，在培养室一定温度和湿度(RH 90一100)下进行发酵。 其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法易被杂菌污染，生产

15、的纤维素酶分离纯化较难且色素不易去除。,.,纤维素酶的发酵工艺,2 固体发酵设备浅盘发酵器 是比较常用的一种固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入浅盘，通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵，工业化程度较低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐，尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更好。 3固体发酵工艺流程,.,4 固体发酵工艺条件 固体发酵过程中的温度、湿度、时间、水分、pH值等因素及其交互作用对发酵有显著影响，对周态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条件的优化，是降低酶制剂成本、提高酶活、实现其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进行固态发酵最好将培养基的起始pH值调为酸性，这样有利

16、于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态发酵培养基的初始含水量，应视纤维素材料种类不同而异。,.,纤维素酶的发酵工艺,玉米秸秆培养基适宜的含水量为1:(22.5)(ww)，麦秸培养基适宜的含水量为1:(11.5)，啤酒糟培养基的含水量为1:1。靖德兵等采用均匀设计U15(58)和双温度培养法(前30 h恒温30，后续恒温27)进行康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素酶条件的研究，结果表明，应用双温度培养法进行康氏木霉固体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基pH值自然(约6.5)并保持环境湿度约60的条件下，72 h是适宜的发酵周期。徐福建等提出了纤维素酶气相双动态固态发酵的方式：在优化条件下(最佳压

17、力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率)，发酵温度得到较好地控制，910 cm高的填料层中最大温度梯度为0.12 scm；以汽爆秸秆为底物，发酵水活度得到较好的保持；动态培养发酵周期(60 h)比静态发酵周期(84 h)缩短了13，酶活(20 136 IUg)比静态酶活(10 182 IUg)提高了1倍，压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况均匀一致且疏松，而静态固态发酵的料层中部几乎没有菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。,.,纤维素酶的发酵工艺,二纤维素酶液态深层发酵工艺 1液态深层发酵工艺特点 液态深层发酵又称全面发酵，是将秸秆等原料粉碎、预处理并灭菌后送至

18、具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐内，接入菌种，借强大的无菌空气或自吸的气流进行充分搅拌，使气、液面积尽量加大而进行发酵。其主要特点是培养条件容易控制，不易染杂菌，生产效率高。液态深层发酵是现代生物技术之一，已成为国内外重要的研究和开发工艺。,.,纤维素酶的发酵工艺,2液态深层发酵设备 液态深层发酵一般采用具有搅拌桨叶和通气系统的菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。 3液态深层发酵工艺流程,.,纤维素酶的发酵工艺,4液体深层发酵工艺条件 液体发酵时问约为70 h，温度一般低于60。液态发酵中使用的接种量明显低于固态发酵，其接种量浓度一般为2一10(vv)。张冬艳等研

19、究了绿色木霉AS.3.3711、康宁木霉A S.3.2774、木霉A S.3.3032和康宁木霉ACC.3.167的适宜发酵产酶条件，结果表明,最适温度为28，产酶适宜的起始pH值为4.55.5。曾青兰等对丝状真菌菌株GibbereUaf可ikuroi产纤维素酶的条件进行了研究，结果表明，接种量为5、培养时间为120h、培养温度为2837、培养基初始pH值为56时，产酶可以达最佳值。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,1.1菌 种 绿色木霉(Trichoderma virlde AS33032)原菌种移接在麦芽汁琼脂斜面培养基上。 1. 2产酶培养基原料 麦麸、汽爆蔗渣、稻

20、草粉，过60目筛备用。 1.3 固态发酵产酶培养基 麦麸：汽爆蔗渣(3：2)，(NH4)SO4,1，加自来水2.5倍量。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.1 氯源的影响 基础固体培养基中其余成分不变，加入不同氮源，28 qc培养4 d，测定酶活力结果表明：绿色木霉在以硫酸铵为氮源的培养基上生长最旺盛，其FPA，CMC和-Case酶活力均较高，所以在以后实验中以硫酸铵为氮源。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.2 碳源的影响 2.2.I 麦麸和蔗渣的比倒对产酶的影响 基础固体培育基中其余成分不变，加入不同比例的麦麸和蔗渣，28培养4 d，测定酶活

21、力结果表明：在一定范围内，麦麸比例越大，菌体生长旺盛，产孢子多，酶活力也逐渐增加；而蔗渣的含量在一定范围内也有刺激酶活力上升的作用两者相互作用，在麸蔗比为3：2时，FPA，0-Gase和CMC酶活力均为最高，这种“诱导”作用，可能是麦麸中的淀粉和微量生长因子以及蔗渣中的纤维素刺激所致。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.2.2 碳源对产酶的影响 分别添加1不同碳源，进行产酶实验。结果大多数代谢中间产物如纤维二糖、木糖、葡萄糖作碳源时，酶活力低，而麦麸作碳源时，纤维素酶较高。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.3 表面活性剂对产酶的影响 添加不同浓

22、度的TweenI80和洗衣粉，进行产酶试验比较。结果表明Tween一80和熊猫牌洗衣粉均能促进绿色木霉产纤维索素，添加0 1 的TweenI80和0 5 07的熊猫牌洗衣粉可分别提高FPA，8一Gase和CMC为2.3倍、2.8倍、2.3倍和3.1倍、3.7倍、3.0倍这主要是由于表面活性剂一定浓度时可以改变真菌的质膜透性，使酶更多地从胞内释放而提高酶的产量然而表面活性剂的浓度过大时，膜可以解体，透性大增，使细胞内电解质大量外渗，加上细胞内各细胞器膜被破坏，各种代谢失调甚至死亡，产酶活力自然受到抑制。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,24 接种方式对产酶的影响 种子悬浮液

23、接种的固态发酵比直接用孢子接种的发酵产酶周期短，但种子悬浮液量不宜过大，若太大将影响产酶培养基的透气性，使产酶活力下降种子悬浮液接种发酵产酶周期短的原因可能是由于种子悬浮液内含有一定量的糖苷酶活，且接种总量大于孢子，分部也比较均匀，这种方式为液固式发酵。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.5 培养基含水量对产酶的影响 固体培养基的水分对于绿色木霉菌种有两方面的作用，一是水分是木霉菌新陈代谢所必须的物质，二是含水量的高低与通气性有着密切关系。在满足木霉菌所需氧情况下，产酶活力随着培养基含水量的增加而增栅若含水量超过250时，通气量不能满足木霉菌生长的需要而使产酶活力下降。

24、,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.6 培养温度对产酶的影响 结果，在较高温和较低温时，绿色木霉产酶活力都较低，28是产酶最佳温度，在较高温状态下，菌体生长较快，但不利于产酶，较低温虽菌体生长较慢，但可延长产酶时间。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化,2.7 起始pH值对产酶的影响 结果，初始pH值对绿色木霉产酶活力影响很大，起始pH 3.5时产酶活力最大，这样低的pH值可防止杂菌污染，通常培养基以略为偏酸为宜但也不能酸度过大，若pH值低于3.5，菌种生长困难，纤维素酶的活力很低。,.,绿色木霉纤维素酶AS33032固态发酵的条件优化结论,(1)碳源

25、和氮源对绿色木霉产纤维素酶有显著的影响，氮源以硫酸铵为佳，且复合碳源中麦麸：甘蔗渣=3：2时产酶活力最高，使一Gase酶活接近FPA水平。 (2)液体种子接种比直接用孢子接种的发酵周期短，但液体种子接种量不宜太大。 (3)表面活性剂对产酶活力影响较大，添加0.1 Tween-80和0.5 0.7熊猫牌洗衣粉都可显著提高绿色木菌产酶活力。 (4)培养基含水量、培养温度和起始pH值对产酶活力都有显著的影响。,.,展望,1、进一步加强纤维素酶的作用机制研究。纤维素酶应用于饲料，作用于动物消化道，其机制尚未清楚。从理论上决定其添加量还很困难，目前只能从实验结果来决定，受影响因素很多，往往效果不够理想。对于单用多种原料的纤维素酶最佳添加量也研究不多，这将严重制约纤维素酶的推广应用。 2、目前纤维素酶的产量和活性都不高，成本偏高，今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工