基因诊断与性传播疾病课件模板-020(共30)

1、基因诊断与性传播疾病 课件模板-20,基因诊断与性传播疾病：第四节 免疫学,第四节 免疫学：,宿主对HPV感染引起的免疫应答，包括细胞免疫与体液免疫两个方面。 一、细胞免疫 人体细胞免疫状态是影响CA发生、转归的重要基础之一。细胞免疫比体液免疫更为重要。临床上伴细胞免疫缺陷的尖锐湿疣患者皮疹常持续不退，其外周血中抑制性T细胞数增多NK细胞功能低下，r-干扰素和白细胞介素2产生减少，而消退疣皮损中常常出现活化T细胞和NK细胞的浸润，部分角朊细胞HLA-DR阳性。,基因诊断与性传播疾病：第四节 免疫学,第四节 免疫学：,免疫抑制或免疫缺陷时，生殖器HPV感染和HPV相关疾病的发生率均增加。尖锐湿疣

2、中辅助性T细胞耗竭，CD4/CD8比值倒置，其值1。在CA病人的外周血中，发现抑制/细胞毒性T细胞百分率显著增高，辅助/诱导性T细胞的比值和辅助/抑制T细胞比值均降低。宫颈CA和宫颈上皮内瘤样病变（CIN）病损中朗格罕细胞明显减少。,基因诊断与性传播疾病：第四节 免疫学,第四节 免疫学：,CA中NK细胞产生r-干扰素和白介素-2减少。鲍温样丘疹病和肛门生殖器癌者中NK细胞对含有HPV-16的角朊细胞的溶解活性下降，可能是对疾病特异性靶细胞的识别缺陷所致，宫颈CA的角朊细胞不表达MHC型抗原(HLA-DR)，无此抗原提呈功能可以破坏免疫监视作用。 二、体液免疫 目前血清学检测结果显示：抗晚期蛋白

3、抗体产生率为25%-65%，较抗早期蛋白抗体产生率高；检测出的HPV抗体似有型特异性，无交叉反应；抗HPV-16E7抗体与宫颈癌的存在有密切关系；抗HPV-16E4抗体也是发生宫颈癌、复发或近期HPV感染的标志；估计成人和儿童产生IgG抗体的阳性率相同，不同型别阳性率在10%-75%之间；已证明HPV-16或18型肿瘤抗体阳性患者中，仅50%-70%可检出该抗体。,基因诊断与性传播疾病：第四节 免疫学,第四节 免疫学：,三、尖锐湿疣自然消退 对CA自然消退尚无系统评估，然而以安慰剂对照研究发现其自然消退率在0%，17%、18%和69%之间，CA消退或治愈后，仍有45%患者存在潜伏感染，其中67

4、%患者复发。,基因诊断与性传播疾病：第五节 发病机理,第五节 发病机理：,尖锐湿疣的HPV感染通过性接触传播，接触部位的小创伤可促进感染，三种鳞状上皮（皮肤、粘膜、化生的）对HPV感染都敏感。每一型HPV与特殊的临床损害有关，且对皮肤或粘膜鳞状上皮各有其好发部位。当含有比较大量病毒颗粒的脱落表层细胞或角蛋白碎片进入易感上皮裂隙中时，感染就可能产生，它可因直接接触或少见的自动接种或经污染的内裤、浴盆、浴巾、便盆感染。,基因诊断与性传播疾病：第五节 发病机理,第五节 发病机理：,病毒感染人体后，可潜伏在基底角朊细胞间，在表皮细胞层复制，HPV侵入细胞核，引起细胞迅速分裂，同时伴随病毒颗粒的繁殖与播

5、散，形成特征性的乳头瘤。晚期基因表达结构多肽，即出现结构蛋白装配颗粒，病毒主要集中在颗粒层中的细胞核内，在表皮的颗粒层出现凹空细胞增多，组织学上正常的上皮细胞也有HPV，治疗后残余的DNA常可导致疾病的复发。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,潜伏期3周到8个月，平均3个月，多见于性活跃的青、中年男女，发病高峰年龄为20-25岁，病程平均在3-5个月的男女患者，在性接触后不久即发病，而病程平均12个月的男性患者，其性接触者可不发病。多数患者一般无症状。损害大小及形状不等。可仅为数个，亦可为多数针头样大的损害：在阴肛部可长成大的肿瘤样物，有压迫感；有恶臭味；有时小的湿疣

6、可出现阴部痛痒不适，病人可出现尿血和排尿困难；直肠内尖锐湿疣可发生疼痛、便血，而直肠内大的湿疣则可引起里急后重感。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,男性患者好发于包皮系带、冠状沟、包皮、尿道、阴茎、肛门周围和阴囊。病初为淡红或污红色粟状大小赘生物，性质柔软，顶端稍尖，逐渐长大或增多。可发展成乳头状或囊状，基底稍宽或有带，表面有颗粒。在肛门部常增大，状如菜花，表面湿润或有出血，在颗粒间常积存有脓液，散发恶臭气味，搔抓后可继发感染。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,位于湿度较低干燥部位的生殖器疣，损害常小而呈扁平疣状。位于湿热湿润部位的疣常表

7、现为丝状或乳头瘤状，易融合成大的团块。有严重肝病的患者湿疣可增大。妊娠可使湿疣复发或生长加快。 亚临床感染是指临床上肉眼不能辨认的病变，但用3%-5%醋酸液局部外涂或湿敷5-10分钟可在HPV感染区域发白，即所谓“醋酸白现象”。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,HPV感染和肿瘤的发生： （一）HPV与皮肤肿瘤的发生有关 它在皮肤癌和其他解剖部位的肿瘤似乎起决定作用。口腔良性赘生物和癌前病变，皮肤鳞状细胞癌组织中可发现HPV-11、16、18型DNA，曾报道喉部HPV-6乳头瘤恶变成喉癌，皮肤疣状表皮发育不良（EV）是HPV潜在致癌作用的证据，EV皮损中发现多种HPV

8、型DNA，并在患者皮肤鳞状细胞癌中检出HPV-5、8、14、17及20型，皮肤鳞状细胞癌似乎是由先已存在的病毒性损害恶变而来。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,（二）尖锐湿疣与肛门生殖器癌 生殖器癌与HPV类型有一定的关系。利用DNA杂交技术发现生殖器癌组织中存在HPV-6、11、16、18型等。 1。宫颈癌：根据HPV与宫颈癌的关系，可将其分为两大类型：低危型主要指HPV-6、11型，高危型是指HPV-16、18型，Gissmann等观察到在侵袭性宫颈癌中，有57.4%患者存在着HPV-16、18型，其他学者也有相同发现。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,

9、第六节 临床表现：,还有人从侵袭性宫颈癌中分离出HPV-33和35型。 2。皮肤鳞状细胞癌（SCC）：HPV感染而发生的CA也可能是癌前损害，并可发展成肛门生殖器SCC，这表明HPV是女阴、阴茎及肛门生殖器SCC的重要因素。CA，巨大CA和疣状SCC组成一个生殖器癌前病变和癌的损害病谱，有些部位生殖器癌病例在其周围皮肤有CA存在，有时肉眼见为典型的CA，但组织学检查中发现SCC的孤立病灶。,基因诊断与性传播疾病：第六节 临床表现,第六节 临床表现：,3。鲍温样丘疹病：常见于阴茎、女阴或肛门周围，曾在皮损内发现HPV-16型DNA。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：

10、,一、醋酸白试验 用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟，病灶部位变白稍隆起，肛门病损可能需要15分钟。本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果，HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同，只有前者才能被醋酸脱色。醋酸白试验检测HPV的敏感性很高，它比常规检测观察组织学变化还好。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性、假阳性变白迹象显得界限不清和不规则。美国CDC提示，醋酸白试验并不是特异试验，且假阳性较常见。 二、免疫组织学检查 常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP），显示湿疣内的病毒蛋白，以证明疣损害中有病毒

11、抗原。HPV蛋白阳性时，尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,三、组织化学检查 取少量病损组织制成涂片，用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原，则抗原抗体结合。在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成红色。此法特异性强且较迅速，对诊断有帮助。 四、病理检查 主要为角化不全，棘层高度肥厚，乳头瘤样增生，表皮突增厚，延长，其增生程度可似假性上皮瘤样。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂、颇似癌变。但细胞排列规则，且增生上皮和真皮

12、之间界限清楚。其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成。此种空泡细胞较正常大，胞浆着色淡、中央有大而圆，深嗜碱性的核。通常真皮水肿、毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润。Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣，表皮极度向下生长，代替了其下面的组织、易与鳞状细胞相混，故须多次活检。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,若有缓慢发展之倾向，则为一种低度恶变的过程，即所谓疣状癌。 五、基因诊断 迄今，HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为HPV检测开辟了新途径。

13、（一）标本的采集及处理 1。标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,在作细胞学检查的同时，将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS离心（3000g，10min）洗涤2次，沉积细胞重悬于1mlPBS中，取0.5ml细胞悬液抽提DNA。 2。标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/l Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37下处理过夜;且等体积酚/氯仿(

14、1:1)，氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/l NaAc（pH5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60l含RNA酶(100g/ml)的TE液(10mmol/l Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37温育30min。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,（二）PCR扩增 1。引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L），每区含一系列开放读码框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有保守序列。Manos

15、等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1，该引物与HPv 6、11、16、18及33型有互补序列，也可扩增其它型HPV。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,Manos等设计的HPVL1通用引物 MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC 表1 HPV型MY11的第1个硷基位置MY09的第1个硷基位置PCR产物长度（bp）6672271704481167077155448166584703545118655870124543365396987448 M=A+C， R=A+G，W=A

16、+T，Y= C+T 表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列，可与 MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列，用于检出的HPV分型。 表2 Manos等设计的HPVL1PCR产物探针 公用混合探针GP1 CTGTTGTTGATACTACACGCAGTACGP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC第一个硷基位置HPV6 6771 HPV11 6757 HPV16 6631HPV18 6607 HPV33 65

17、88型特异探针探针HPV型序列基因位置MY12HPV6CATCCGTAACTACATCTTCCA68136833MY13HPV11TCTGTGTCTAAATCTGCTACA68006820MY14HPV16CATACACCTCCAGCACCTAA69266945MY74HPV18GGATGCTGCACCGGTCTGA69056922MY16HPV33CACACAAGTAACTAGCTACAG66286648 H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T 2。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/

18、l dNTP贮备液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10PCR缓冲液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100mol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,3。PCR扩增方法和程序：以100lPCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。 （1）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3。 表3每支反应管中

19、的PCR反应试剂 反应试剂体积（l）终浓度10PCR缓冲液101PCR缓冲液dNTP贮备液2200mol/L每种dNTPMY11贮备液0.5500mol/LMY09贮备液0.5500mol/LTaq DNA聚合酶0.52.5灭菌蒸馏水75.5总计90.0 （2）各反应管依次加入10l标本和90l预混反应试剂。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,（3）加入80-100l石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前，PCR试剂已商品化，反应体积为25l。使用时只加入标本DNA即可。 （4）将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为9530s，55 40s，72 50s循环35次，最后72延伸5min。,基因诊断与性传播疾病：第七节 实验室检查,第七节 实验室检查：,4。每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如Caski、HeLa）DNA为阳性对照，以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。 （三）扩增产物的检测和分析 1。凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10l扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DN