感染性疾病的分子诊断ppt课件

1、第八、第九章感染性疾病的分子诊断、感染的感慨、感染是病原体与人体之间的相互作用过程病原微生物：病原菌(条件病原菌)、微生物、人体、微生物、人体、不同的感染状态、共生状态、正常情况下，人体的一部分空洞和体表寄生着微生物， 感染性疾病：某些病原体以不同方式引起人体感染，出现临床症状的疾病病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体、寄生虫。常规检查方法：免疫学方法的微生物学方法受到敏感性、特异性限制，难以早期诊断，难以提供病原体的分类和耐药性信息。感染性疾病的分子诊断战略、一般战略(病原体检测): 判断有无感染的病原体感染的常用方法： PCR杂交完整性战略：病原体的分类(分类) -

2、亚型-耐药性的常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA序列确定、感染性疾病的分子诊断标记病原体核酸分子(DNA/RNA ) 基因表达产物代谢物免疫应答分子，二、感染性疾病分子诊断的常用方法，根据目的基因是否扩增可分为杂交法和扩增法。 信号放大技术的测定方法虽然目标分子的数量不变，但测定的探针信号放大采用酶、探针或者两者结合等方法，增加探针标记的浓度来放大测定信号。 目标分子扩增技术的测定方法目标分子(RNA、DNA或探针)的扩增PCR、替代扩增、LCR等图8-3 NASBA的原理图，引物a5端有T7RNA聚合酶结合部位， 3端碱基与目标rna3端的序列互补的引物b的碱基序列与cdna3端序列互

3、补，nucleicacidsequence-based amplification (nasba )、NASBA的特征操作简便，无需特殊设备整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，保真度高，其扩增效率比PCR高，特异性好。图8-3 NASBA的原理图，引物a5的末端有T7RNA聚合酶结合部位，3的末端碱基和目标rna3的末端序列互补的引物b的碱基序列与cdna3末端序列互补，nucleicacidsequence-b 整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，保真度高，其扩增效率比PCR高，特异性好。三、感染性疾病的分子诊断标本处理、标本采集处理主要进行合适的标本种类、标本量、抗凝剂等的选择和标本的

4、适当移送、保存和预处理。四、感染性疾病分子诊断结果表明，1 .阴性结果假阴性可能性方法灵敏度过低的方法，靶分子2 .阳性结果假阳性可能性方法的特异性受到污染.3.定性检查结果可能无法提供病原体活力相关信息.临床治疗症状缓解后一定时间内，患者样品可检测出相应的病原体。 部分病原体潜伏在体内，没有临床症状。 4 .在疾病状况的判断中检测出病原体的存在，不能说是这个病原体引起疾病的直接原因。 该病原体可能是正常菌群，五用于感染性疾病分子诊断的临床应用和评价、感染性疾病治疗的监测和预测、病情发展过程的危险性评价和疾病预后等。 耐药性检查细菌的分型传染病调查，第一节病毒的基因检查，人多的感染症起因于病毒

5、，病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等，约占人感染症的75%。 400多种病毒。 病毒结构：大小： 20-300nm的核心区：核酸(DNA或RNA )的外周涂层：蛋白质包膜：脂质(嵌入蛋白质)，中国是HBV的流行地区，50%-70%的人感染，8%-10%是HBV载体，肝炎患者外壳(HBsAg):外壳蛋白质成分由表面抗原核(HBcAg):DNA聚合酶hbcag，一，乙型肝炎病毒，Dane粒子(完全病毒)形态，完全的乙型肝炎病毒粒径42纳米由双重外壳和一个核组成，核径为含有DNA双链和DNA聚合酶的(1)病毒基因组结构，3.2kb双链DNA病毒不完全双链DNA长链l为负链： 4个开放阅读框s、c、p、X

6、 S区编码外膜蛋白(HBsAg) C区编码HBeAg、HBcAg p区短链s为正链：长短不同，pre-s1、pre-s2、s、p、c、pre-c、x、HBV DNA 3.2 kb、pre-S1 pre-S1蛋白pre-S2 pre-S2蛋白shbsagpre-chbeaghbcagndnapxhb 、HBV基因的分类、HBV基因的序列差异，可以将HBV分为不同的基因型，迄今为止发现了a、b、c、d、e、f、g、h共8种基因型： a型主要存在于白人，b型和c型主要存在于亚洲人，e型主要存在于亚洲人我国流行的主要是b和c基因型，长江以北以c型为主，长江以南以b型为主，并与少量的a型、d型混合型。

7、西北和西南，特别是西北有高比例的d型，a (，mRNA，cccDNA，HBsAg被膜，负链DNA，包围的前基因mRNA，传染性HBV病毒粒子，传染性HBV病毒粒子，部分双链DNA， 肝细胞，(二)分子诊断，常用的免疫学检查方法，即两半的检查都有窗口期间，很难早期诊断。 1.PCR一般采用PCR、FQ-PCR、竞争PCR、免疫杂交PCR，可直接提供准确的病原学诊断证据。 引物基于s、c、p、x基因的高级保守序列设计，决定扩增的特异性和灵敏度。扩增位置引物序列扩增片段(bp) P， x基因5atactgcggaactcctagc-3278ccgcgtaagagagagagagtgcg-3c基因5a

8、taccacagatcagactcgtggactgactgaaa tggacattacccctataa-32585- atgggatctggaatgcggtctccaa-3，在某些情况下，RLFP斑点杂交Southern杂交，2 .分支DNA信号放大技术(bDNA )，以证实放大产物的特异性捕获探针固化在微板上的目标探针1包括：与捕获探针和测定对象核酸分别杂交的目标探针2、与测定对象核酸和bDNA分别杂交的复合体：固相支撑体、捕获探针、目标探针1 CEs、测定对象核酸目标探针2 LEs bDNA复合物，支链DNA信号扩增技术(bDNA ) .信号检测： bDNA可以结合多种酶标记探针，酶催化基

9、质(1，2 -二恶英，dioxetane )发光，放大核酸信号，发光强度与DNA量成比例。 优点：放大倍率阳性检测率高，稳定性高，重现性简单，省时间容易普及，3 .基因芯片技术标本在PCR放大后与芯片上的特异探针杂交，病毒感染病毒的种类和亚型病毒的抗性情况特征：可同时进行大量标本的检测，近年来陆续上市干扰素治疗HBV的压力主要集中在前C/C区和前s区。 HBV抗性突变、lamivudine、adefovir、entecavir、telbivudine、YMDD (酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)、HBV的拉米夫定抗性取决于HBV DNA聚合酶突变。 抗性基因位点(YMDD )位于聚合酶的c区(r

10、tM2041或rtM204V )，分别由亮氨酸(I )或缬氨酸(v )替换YMDD中的蛋氨酸(m )，形成YIDD或YVDD变异。拉米夫定和HBV逆转录酶的亲和力与位于552位的氨基酸侧链长有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，缩短侧链氨基酸长，增大逆转录酶dNTP结合区，不适合拉米夫定结合，诱发耐药性。HBV抗性检测(YMDD突变检测方法)、YMDD突变检测方法、1 .基因测序法2 .荧光定量PCR方法的基本原理是确定探针特定的TM值，用突变的常用方法复盖突变部位的荧光双探针杂交，YIDD YMDD YVDD， 由于46.91 54.64 50.74，1 .免疫学检测敏感性： 0.1g/ml核酸

11、杂交检测敏感性： 0.1pg/ml PCR检测： 0.1fg/ml，因此在感染早期通过DNA检测可以证明病毒的存在。2 .监测疗效： HBVDNA107复制/ml提示病毒复制活跃，治疗HBVDNA104复制/ml有一定疗效HBVDNA103复制/ml，HBeAg阴性，转氨4 .检测耐病毒乙型肝炎病毒DNA聚合酶YMDD的突变是病毒耐药性的重要原因，通过监测YMDD的突变情况，可以获得有关病毒耐药性的信息，指导抗病毒治疗。二、流行性感冒病毒流行性感冒病毒(Influenza virus )可分为引起流行性感冒的病原体甲(a )、乙(b )和丙(c )三种类型，病毒粒子表面的凝集素(Haemagg

12、lutinin，HA )和神经氨酸酶a型流感病毒容易发生变异，病原力强，1918年西侧发生的大流感杀死数千万人，是由于a型流感病毒引起的。 the rarer 16差异(h1toh 16 )差异(n1ton9)流感病毒基因组结构单链RNA病毒， RNA有8个负链RNA片段或7个RNA片段。所有RNA片段5末端和3末端保守的2种不同的亚型病毒感染宿主时，生成重组新病毒的RNA基因多在复制中发生突变。(二)分子诊断法可以使用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒RNA。 引物多是以流感病毒保守的非结构基因(NS )序列设计的。 为了验证PCR扩增产物的特异性，并提高检测灵敏度，采用限制酶分析法、斑

13、点杂交法、南方印迹法进行了扩增产物的分析。扩增位置引物序列扩增片段尺寸NS基因5aaggcttcaccagagg 3190 (BP ) 5cccattctctactgcttc 3ns基因5atggccatcggatcaac 3241 (BP )。 5tgtcagctattatggactg 3、(3)临床意义流感病毒的诊断主要依靠鸡胚羊膜腔培养和血清学凝血抑制试验，但这些方法比较耗时，灵敏度低，难以早期诊断。 PCR法敏感、特异、简便、快速，且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。三.人类免疫缺陷病毒(HIV )、HIV、human immunodeficiency virus AIDS、acqu

14、iredimmunodeficicysyndromehiv是艾滋病的病原体。 现在发现了艾滋病病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三种。 1998年末艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3.340万人，已经死亡1.390万人，是世界主要死因之一。最外层是囊膜、双脂蛋白，病毒攻击宿主细胞不可或缺的其中是核衣壳。，2 .基因组结构的逆转录病毒，两个拷贝的一条正链RNA； 每个RNA的长度约9.7Kb，有5帽子，3端有多尾的HIV是变异激烈的病毒。包含gag、env和pol三个基因和6个控制基因tat、vif、vpr、vpx、nef、rev。gag基因编码病毒核心蛋白质； pol基因编码病毒复制所需的酶类(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)env基因编码的病毒包复蛋白是HIV免疫学诊断的主要抗原。 调控基因编码辅助蛋白，调控病毒蛋白的合成和复制。，(二)分子诊断法，抗体的检测：酶联免疫吸附法(ELISA )和免疫荧光检测法(IFA )感染两周后能产生病毒抗体的抗原的检测：酶联免疫吸附法(ELISA )检测P24抗原，灵敏度低，1 .病毒承载量是感染者体内HIV的目前常用的三种技术： RT-PCR最低检测限50拷贝/ml bDNA最低检测限50拷贝/ml NASBA最低检测限20拷贝/ml，将PCR RNA逆转