核酸检测技术及质量控制(王凤鸣)ppt课件

1、.核酸检测技术和质量控制、常州市疾病预防控制中心王凤鸣、目录、一、PCR实验技术操作要点2、质量控制要点3、实验室生物安全管理、一、PCR实验技术操作要点、常用仪器设备、样品器、PCR实验室准备4套连续调整样品器，分别为试剂准备、 样品器的类型，单通道连续可变式移液管单通道与连续可变式移液管单通道移液管并用，样品器的使用，样品器的校正，校正方式从计量局制造商的比较时间开始使用频率(6个月-1年)，样品器-注意事项，根据需要的液量吸收液体时要慢慢等速吸收，在排出液体不要沾到移液管头后，大拇指不能松开按钮。 按下移液管喷嘴，放开拇指，使液体不返回。 调整摄取液量的旋钮时，请勿强行用力。 另外，请注

2、意计数器的值不要超出可调整范围。 连续调整式移液管不能在没有吸引口时使用。 吸引口有液体时，不能弄平或倒过来。 (1)高速(冷冻)离心机，马达转速最低转速为最高转速，消毒方式的标准零件系统噪音，高速(冷冻)离心机-使用方法，离心机应该放置在水平坚固的地板和平台上，离心力应放置在水平的位置，以免机器振动。 打开电源开关，根据需要安装旋转轴，预先将平衡了的样品放在旋转轴的样品架子上，关闭盖子。 按下功能选择键，就会设定温度、速度、时间、加速度、减速度等要求，用电脑控制的机器为了存储输入的信息，必须按下存储键。 打开盖子直到离心机完全停止转动，取出离心样品，用柔软的清洁布擦拭转轴和机械室的内壁，离心

3、机室内的温度和室温平衡后就可以关闭盖子。 机体应始终处于水平位置，外部电源系统电压匹配，需要良好的接地线。 接通电源前，要检查转动脖子是否紧紧按着，机械室有没有异物掉下来。 运行离心分离机时，离心分离机周围30cm范围内不得有人或危险物。 挥发性或腐蚀性液体离心时，请使用带帽的离心管，避免液体泄漏，以免腐蚀型腔或引起事故。 高速(冷冻)离心机-使用方法，易燃、易爆炸的物质和其他物质不能离心。 在没有相应的防护措施的情况下，不得离心有毒的放射性物质和病原微生物。 离心机运行时，不能用人手打开盖子。 如果旋转轴和盖子上有腐蚀或磨损的痕迹，请立即停止使用。 使用的玻璃和塑料的离心管可以承受相应的离心

4、力和大小。 不能转动头部照射紫外光。 高速(冷冻)离心分离机-使用方法，全自动核酸提取器，全自动核酸提取器，全自动核酸提取器，基于核酸的分子诊断技术，病毒粒子，DNA，RNA，FQ-PCR，RT-FQ PCR，、病毒荧光定量PCR反应，反应体系的配置，反应条件的设定， 对照设定：阴性对照：灭菌双蒸水替代标本阳性对照：提取的阳性核酸标本.典型的荧光定量PCR结果，阳性标本放大曲线阴性标本放大曲线.二，质量控制要点.PCR实验技术的质量控制要点，分子生物学实验室的质量控制关系到基因检测放大的全阶段，确保了检测结果的正确性和可靠性，各种氯PCR实验技术的质量控制要点，PCR实验的过程主要是标本处理和

5、核酸提取扩增试剂的准备核酸扩增和产物分析测定后的结果报告，PCR实验技术的质量控制要点高质量无污染无分解的核酸制备，严格执行分区操作试剂贮藏和准备区标本处理和核酸调制区核酸扩增产物分析区实验者的操作技能， 理想的PCR实验室区划设计模式是各区独立关注风向，根据土地情况工作，设定PCR实验室设计的一般原则、标本处理和核酸提取的质量控制核酸提取试剂的选择核酸扩增试剂的分注保存试剂的配置对照的核酸扩增设备扩增参数， 扩增产物检测和分析荧光定量普通凝胶电泳毛细管电泳，污染控制和预防，常见污染源控制污染对策的消除对策，三，实验室生物安全管理，为什么要关注实验室生物安全？ SARS流行后期的实验室感染事件

6、于2003年9月8日：在新加坡国立大学实验室，P3实验室同时开展悉尼病毒和SARS病毒的研究，27岁的中国研究员感染了2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，47岁的中学研究员， 在P3实验室清洁SARS实验后废弃物时，因未戴手套而感染的2004年4月22日：在中国CDC病毒所，跨室展开SARS病毒研究，有三代、九例，另2例引起一例死亡的“隐性”感染者。引起实验室生物污染的原因多，人员生物安全概念弱，技术操作不当的生物安全柜和高压灭菌容器的不当使用或不当使用样品的交接、接受和使用，装有冻干感染性物质的安瓿的开封均化器、组织研磨机、摇床、 搅拌机、超声波处理器的使用离心分离机内含有潜

7、在感染性物质的离心管破裂，造成生物安全概念、实验室生物安全危险的生物因子对实验室人的暴露、向实验室外扩散和危害的综合措施。 生物安全的三个方面：指人的健康安全第二个是指人生存的农业生物的安全第三个是指与人的生存相关的环境生物的安全。 微生物实验室生物安全，三项技术措施样品隔离技术(机械，气帘):防止感染因子侵入环境的面向人体的气流技术(负压系统):防止感染因子扩散的消毒灭菌技术(物理，化学):使感染因子灭活， 实验室分为基础实验室一级生物安全水平基础实验室二级生物安全水平防护实验室3354三级生物安全水平最高防护实验室3354四级生物安全水平，基于操作不同危险水平微生物所需的实验室设计特征、建

8、筑结构、防护设施、设备、操作及操作程序.实验室的生物安全防护栏、一级防护栏由生物安全盘和个人防护设备等组成的防护栏。 生物安全存储模块的高效空气过滤器. 由实验室的生物安全防护墙、二次防护墙设施的构造和通风系统等构成的防护墙。 “箱子里的箱子”的结构、实验室生物安全防护水平的等级、生物安全水平的等级根据生物因子的危害程度和对策，将生物安全防护水平(biosafety level，BSL )分为4个阶段(BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示)。 动物实验室用ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3和ABSL-4表示。与一般生物清洗室的不同，1 .工作目的BSL实验室：主要是保护工作

9、人员和环境，也保护产品。 安全是第一考虑。 生物洁净室：以保护产品(工作对象)为主。 清洁是第一个考虑因素，2 .污染物的种类和BSL实验室：目标微生物。 在内部发生。 生物洁净室：粉尘(可能的热源)和微生物。 会产生外部的入侵和人的活动。、与普通生物清洗室的差异、3 .空气污染物处理方式BSL实验室：平面布局和气流的作用、发生环节在一级屏障内进行个体保护。 生物洁净室：主要通过进气净化来减少活动。 4、清洁、污垢的概念BSL实验室：有目标微生物就视为污垢没有目标的微生物都要仔细分析被视为清洁的各环节的清洁、污垢。 生物清洁室：粉尘、微生物(特别是超过标准者)和废弃物均被视为污垢。与一般的生物

10、洁净室不同.5.排气处理方式BSL实验室：室内室外不允许的排气必须进行净化，风不能回来. 生物净化室：一般室内室外； 排气可以回气。 6、实验室软件、硬件的作用BSL实验室：为了保护工作人员，实验室软件必须是决定性的环境保护，实验室硬件必须是决定性的生物洁净室：一切都很重要，硬件设施的作用很大与一般生物清洗室的不同，7 .压力增加方向BSL实验室：缓冲室准备室准备室主清洗室、保护对象、操作区、压力、气体排出方式、设备、设备、制造、样品， 环境、负压、净化后排出、复杂、高价、样品、正压、直接排出、简单、便宜、生物安全盘和洁净台的差异，BSL-1实验室的门可以打开窗户关闭。 2 )在实验室入口处设

11、置衣架装置，把个人便服和工作服分开。 3 )实验室各表面平坦清洁，不出水，耐腐蚀。 4 )实验台的防水、耐腐蚀、耐热。 5 )柜子和实验台很牢固，为了清洁保持一定的距离。 6 )实验室可以利用自然通风。 如果采用机械通风，必须避免交叉污染。BSL-1实验室，7 )如果有能打开的窗户就设置纱窗。 8 )保证工作照明，避免不必要的光和强光。 9 )有适当的消毒设备。 10 )操作有毒、刺激性、放射性挥发物质时，根据风险评价设置适当的负压排气盘。 11 )设置紧急照明装置需要充分的电力供给。 12 )有必要采取措施防止节足动物和啮齿动物进入。符合典型一级生物安全水平实验室、BSL-2实验室、BSL-1的要求。 2 )实验室的门自动关闭，门禁系统。 3 )实验室工作场所必须设置洗眼装置。 4 )必须在实验室及其建筑物内设置高压蒸汽灭菌器和其他适当的消毒灭菌设备。 5 )在操作病原微生物的实验期间，必须设置生物安全盘。 6 )需要可靠的电力供给。BSL-2实验室，生物危害警告标志。 典型的二级生物安全水平实验室、生物安全盘、生物安全盘要求：颗粒用HEPA过滤器去除气流层流气流方向，生物安全盘等级，级生物安全盘：保护员工和环境的级生物安全盘：员工