基因工程原理与技术

1、第五章聚合酶链反应聚合酶链反应是一种在体外快速扩增靶核酸序列的技术。1971年，科兰纳等人提出了“在体外进行DNA变性，用合适的引物杂交，然后用DNA聚合酶延伸克隆DNA”的想法。1983年，穆利斯发明了聚合酶链反应技术。1988年，斋祀等人将耐热的Taq聚合酶引入聚合酶链反应技术。1989年，聚合酶链反应被美国杂志Science列为十多项重大科学发明的第一项。穆利斯获得了1993年诺贝尔化学奖。应用：生命科学、医学、法医学和考古学。第一节PCR原理遵循体内DNA复制和半保留扩增的原理；扩增序列取决于一对设计引物(正向引物和反向引物)，有效扩增长度约为2kb扩增循环包括三个阶段：变性、退火和延

2、伸。30 35个周期后，靶序列呈指数扩增(2n-2)。第二节聚合酶链反应反应体系一，反应体系，二，反应参数，三、影响聚合酶链反应的因素1、反应组分引物；浓度和长度DNA聚合酶；型(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)，剂量dntp；浓度和比例Mg2；影响Taq DNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板熔化温度、产物特异性、引物二聚体形成等。反应缓冲液；在pH8.3时，KCl可以促进引物退火，但其浓度大于50毫摩尔/升，这抑制了酶的活性。模板DNA。线性DNA的扩增效应大于环状DNA。反应条件变性温度和时间；热启动降低了非特异性扩增退火的温度和时间；根据引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为T

3、m-5。退火温度越高，扩增特异性越高。延长温度和时间。延伸时间取决于目标序列的长度和延伸温度。2 kb长的靶序列扩增时间为1分钟(72)。平台效应平台效应是指随着循环次数的增加，聚合酶链反应后期的扩增产物不再明显上升，反应曲线变平的现象。导致平台效应的因素有：dNTP或引物耗尽；酶活性逐渐降低；最终产物(焦磷酸、双链DNA)的抑制；非特定产品和模板之间的竞争；产品在高浓度下变性不完全；低浓度的非特异性产物开始大量扩增。聚合酶链反应的特点：灵敏度高简单快速对样品纯度要求低。第三节聚合酶链反应的引物设计原则一、引物设计的一般原则提高特异性扩增并减少非特异性扩增。第二，引物设计的一般原则引物长度应为

4、1530个核苷酸，Tm接近72；TM=(G C) 4 (A T) 2 引物中碱基的分布应是随机的，以避免一系列单碱基导致二级结构。羧甲基纤维素的含量约为45% 55%；引物的3端必须与模板互补，但5端可能不互补。引物中连续互补碱基的数量应少于4个；引物间的连续互补碱基应少于4个。引物3末端的最后一个碱基：A是优选的，接下来是G和C，不选择T。因为当非碱基为t时，即使在错配的情况下，链的合成也可以开始；然而，当非碱基为a时，错配的引发效率大大降低；如果是g或c，起始速率在中间。当然，在设计简并引物时，选择T作为3末端的最后一个碱基会得到更好的结果。4.引物设计软件寡6.57引物5.0，第4节，聚

5、合酶链反应1的类型。已知脱氧核糖核酸序列的聚合酶链反应扩增1。套式聚合酶链反应不受平台效应的限制，扩增灵敏度提高了1000倍。嘿。2。热套式聚合酶链反应的第二个引物之一用放射性物质标记，这增加了电泳检测的灵敏度，并且可以检测106个细胞中的一个DNA分子。3.半巢式聚合酶链反应(见下图)。4.不对称聚合酶链反应使用两种不同浓度的引物(50:1)。主要用于制备用于DNA测序的单链模板和制备杂交探针。等位基因特异性聚合酶链反应检测然而，一些不匹配的碱基不能完全阻止引物延伸。6.竞争性引物聚合酶链反应用于检测特定位点的点突变。设计了两条等位基因特异性引物，一条是正常引物，另一条是突变引物，突变碱基在

6、引物中间，扩增产物相差20倍以上。因为标记了一个引物，所以可以检测不同样品的扩增差异。在一个聚合酶链反应中，设计了一个多循环反应程序，第一个程序的退火温度高于Tm，然后每个程序的退火温度逐渐降低，以确保第一次扩增的特异性，因此低退火温度不会影响扩增的特异性，因为目标产物在前几个循环中已经被指数地扩增。它通常用于根据氨基酸序列设计的简并引物的扩增和多基因家族成员的扩增。反转录聚合酶链式反应(逆转录聚合酶链式反应)反转录聚合酶链式反应是指在逆转录酶的作用下，以核糖核酸和寡核苷酸为引物，合成第一条cDNA链，然后用一对已知的引物扩增cDNA片段的技术。它主要用于基因表达、cDNA克隆、逆转录病毒鉴定

7、等。逆转录-聚合酶链反应引物的设计原则是：最佳引物限制区为180 500 BP回文序列结构不应存在于引物的5和3端；当寡核苷酸(dT)n用作第一链cDNA逆转录的引物时，有义引物应尽可能位于RNA的3端；基因组DNA应在引物限制区有一个内含子，以便检测污染；最好在聚合酶链反应引物的有限区域有一个酶切位点来鉴定产物；3.用限制性酶位点序列快速扩增cDNA末端(RACE，锚式聚合酶链反应)，杂交引物： 17nt寡核苷酸(dT)(锚式引物)。基因特异性引物5RACE的缺点是它不能得到真正的5端。因为第一链cDNA的过早终止可以像全长cDNA一样被末端转移酶跟踪。3RACE，5RACE，新款5RACE

8、。4。未知序列的聚合酶链反应扩增，侧翼是已知序列1。反向聚合酶链反应。2。锅柄聚合酶链反应。5。未知序列的聚合酶链反应扩增1。差异显示聚合酶链反应，锚定引物，N9:随机引物。2、驱动器是普通材料。六。荧光定量聚合酶链反应(实时定量聚合酶链反应)荧光染料(EB):结合双链DNA可以增强荧光，但结合是非特异性的。荧光标记探针(见图):利用Taq酶的核酸外切酶活性，在扩增过程中探针被切断，释放荧光基团，从而增强荧光。特异性强的用途：检测致病菌和基因表达。r:荧光基团；q:淬灭剂组。第5节聚合酶链反应技术的应用1。基因克隆与筛选。基于聚合酶链反应的分子标记有RAPD、SSR、AFLP等。应用于遗传图谱构建、生物进化、遗传多样性等研究。3.DNA测