如何构建质粒克隆.ppt

1、1,如何构建质粒克隆,周鸿雁 2011.06.15,2,目的基因,目的载体,Bax,pCMV-Sport 6,EcoR,Bgl,连接Bax基因至EGFP载体 思路,加入 EcoR酶切位点,加入 Bgl 酶切位点,连接 酶切 目的基因两侧加入酶切位点,3,MCS 多克隆位点,Bax,pCMV-Sport 6,缺点： 无荧光：GFP、Dsred 无标签: Flag、 HA、 Myc,4,pCMVSPORT6 MCS,Gene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562 Insert site：EcoRI, XhoI,5,构建过程, 设计引物 (增加酶切位点, Bgl, EcoR)

2、 目的基因PCR 双酶切载体 (Bgl, EcoR) 琼脂糖凝胶电泳 DNA 胶回收 ( 基因 ,载体) 双酶切目的基因 (Bgl, EcoR) 目的基因与载体相连 DH5转化 鉴定,6,第一步： 设计目的基因PCR引物 目的： 1）通过PCR方法扩增目的基因 2）在目的基因片断两端增加酶加位点,酶切位点旁需加入保护碱基,7,设计引物前需解决的问题, 1、选择酶切位点 2、选择保护碱基 3、终止密码子,8,PEGFP MCS,选择酶切插入位点： 1、两个酶切位点间隔远 2、目的基因序列中无相应酶切位点 3、酶切缓冲液一致,9,BAX insert sequence,atggacgggtccgg

3、ggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaact

4、tcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga,10,*,*,DNAStar软件 - MapDraw功能,11,A

5、GATCT - Bgl buffer 3 GAATTC -EcoR I buffer 3,AGATCT 目的基因 CTTAAG,AGATCT -目的基因- CTTAAG,PCR产物,产物酶切效率低、不准确 ！,12,酶切位点保护碱基,protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90%,切割率,提高酶切活性、增加酶切效率、缩短酶切时间,保护碱基: 限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响

6、,13,设计引物原则,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp， 引物序列的GC含量一般为40-60% 2. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳 3. 避免引物二聚体及发夹结构 4. 引物的特异性 5. 碱基随机分布,14,cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length -21, GC%-71.8%, Tm-71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcc

7、cccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length -25, GC%-52%, Tm-68.4),设计引物 Primer 5软件,15,引物中是否应包含终止密码子？,MCS在EGFP之后表达，需加终止密码子,MCS在DsRed之前表达，不可以加终止密码子,16,加入保护碱基及酶切位点,Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG,17, MCS与荧光相连的地方应特别注意有无移码,调整开放阅读框（ORF）,18,荧光表达在前时(

8、EGFP),Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG 因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理会,19,荧光表达在后时 (DsRed),Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg,20,荧光表达在后时需加KOZAK 序列,Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaaga

9、tgagtctcccgg KOZAK 序列: gccacc, 加在起始密码子之前,21,Primer final,Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG,22,33.5 uL dH2O 10 uL phusion HF buffer 1 uL dNTP(10mM) 2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO 0.5uL phusion polymerase 50 uL,1. 98(1min) 2. 98 (5s) 3.

10、65(20s) 4. 72(20s) 5. back to step 2 for 25 times 6. 72 (10min) 7. 18 for ever,第二步：PCR目的基因,Phusion超保真PCR试剂盒,23,Buffer3 : 2ul vector: 4ul 100%BSA: 0.2ul EcoR : 1ul Bgl: 2ul ddH2O: 10.8ul,37 4h,EcoR,Bgl,第三步：双酶切载体,20ul,24,第四步：琼脂糖凝胶电泳、 凝胶回收,0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V,目的基因,5kb 2.5kb,载体,25

11、,Buffer3 : 2ul BAX: 15ul 100%BSA: 0.2ul EcoR : 0.5ul Bgl: 1ul ddH2O: 1.3ul,37 4h,第五步：双酶切及回收目的基因,20ul,TAKARA片断回收试剂盒,26,第六步：回收效率验证,5kb 2.5kb,Loading volume: 5ul,From left to right: Marker: 15000bp EGFP BAX restriction BAX PCR Marker:100bp,27,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax: 3ul vector: 1ul d

12、dH2O: 13ul,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 6ul vector : 1ul ddH2O: 10ul,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 10ul vector : 1ul ddH2O: 6ul,(1) (2) (3),16 过夜,第六步：连接,载体100ng:,100 x目的基因分子量,载体分子量,X 4/110/1,目的基因的量为:,28,第七步：转化,100ul DH5 + 20ul 连接产物,29,第八步：验证 (1),PCR,1-12,13-24,Positive: 2,7,9,10,5.4 uL dH2O 2 uL phusion HF buffer 0.2 uL dNTP(10mM) 0.5uL primer forward 0.5 uL primer reward 1uL 菌液稀释液 0.3ul DMSO 0.1uL phusion polymerase 10 uL,30,第八步：验证 (2),双酶切