免疫血清学技术

1、免疫血清学技术 概念： 抗原与抗体在体内或体外均发生特异性结合反应，因为抗体主要来自血清，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。 一、 概述 按抗原抗体反应性质不同分为： 凝聚性反应：凝集试验、沉淀反应 标记抗体技术：荧光抗体、酶标抗体、生物素标记抗体、 同位素标记抗体、其他标记抗体技术 有补体参与的反应：补体结合反应、免疫粘附血凝试验 中和反应：病毒中和试验、毒素中和试验 免疫转印（Western Blot）,1、 血清学反应的一般特点 特异性与交叉性： 特异性：血清学反应具有高度的特异性，如抗猪瘟病毒抗体只能与 猪瘟病毒结合，不能与伪狂犬病病毒结合。 交叉性：两种抗原之间

2、含有共同抗原的时侯，有时也发生交叉反应， 如伤寒沙门氏菌与霍乱沙门氏菌常发生交叉反应。 抗原抗体结合机理： 以非共价键结合 结合力（亲和力）：抗原决定族和抗体结合点之间形成的非共价键的数 量、性质、距离。,结合的可逆性 Ab + Ag Ab-Ag 复合物 最适比与带现象：参与反应的抗原抗体的比例 反应的二阶段性： 第一、抗原抗体发生特异性反应， 第二、抗原抗体反应的可见阶段：凝集、沉淀、补体结合。 影响反应的因素 电解质、温度、酸碱度,二、 凝聚性试验 凝集反应: 细菌红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在下, 产生可见的颗粒凝集现象。 直接凝集试验： 玻片法：鸡白痢玻片凝集 试管法：布氏

3、杆菌试管凝集 间接凝集试验： 间接血凝试验：猪瘟间接血凝试验 乳胶凝集试验：猪伪狂犬病乳胶凝集试验 协同凝集试验： SPA + Ab SPA-Ab + Ag SPA-Ab-Ag,2. 沉淀试验： 可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质存 在情况下，产生可见的沉淀物。 （1）环状沉淀反应： 小口径试管中进行，先加已知血清0.1 ml，然后轻轻加入等量抗原，使 形成二个界面，数分钟后，二个界面间形成乳白色的沉淀环。 如：炭疽环状沉淀反应: Ascoli 反应 （2）琼脂扩散试验： 琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于水，冷却后凝固，形成 凝胶，呈多孔结构，充满水分，允许

4、各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比 例适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。 包括： 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 如：马立克氏病 法氏囊病的诊断,（3）免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。 包括：免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳,Ab,Ab,Ag,Ag,+,_,对流免疫电泳,三、 抗体标记技术 Ab + Ag Ab-Ag (含量低时不可见) 荧光素 酶 放射性同位素 生物素-亲和素 标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的一类技术,抗体标记技术包括： 荧光素标记抗体技术 酶标记抗体技术 生物素-亲和素标记抗体技术 放射性同位素标记技术 其他标记技术：胶体金标记技术,标记

5、核酸探针技术 ATGCCTTGAC TACGGAACTG TACGGAACTG 放射性同位素,四、 补体结合反应 补体结合试验（Complement fixation）： 是应用蛋白质、多糖、类脂质、病毒等可溶性抗原与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可结合补体，但肉眼看不见，再加入致敏红血球，即可根据是否溶血判断抗原抗体的存在。 有5 个要素： 抗原（待检） 抗体 补体 红细胞 溶血素（抗红细胞抗体）,Ag,Ab,+,C,Ag,Ab,+,C,Ag,Ab,补体结合反应的基本原理,Ag?,Ab,C,E,H,Ag+,Ab,C,E,H,+,不溶血,Ag-,Ab,C,E,H,Ag-,Ab,C,E,H,溶

6、血,五、 中和试验 抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去 毒力，接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。 1. 终点法中和试验（End-point neutralizing test）: 固定病毒稀释血清法：将已知病毒量固定（200 TCID50），把 血清作倍比稀释，测定血清中抗体的中和效价。 固定血清稀释病毒法：将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列试 管，第一列加等量阴性血清（对照组），第二列加待检血清（中和组）， 混和后置 37 1h ，分别接种动物（鸡胚、细胞培养），记录死亡数，用 Reed 法Muench 计算半数致死量（LD50）。,2. 空班减少试验 ( Plague reduction test)： 应用空斑技术使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。 将已知空斑单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含 100 PFU，加等量递进稀释的血清，37 1h 。接种细胞后， 覆盖琼脂，培养数天后，计算空斑数，计算血清的中和滴度。,血清学反应的应用 1. 抗