第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆

1、我的细胞培养计划(既可以手写也可以印刷)应包括以下内容： 1、培养目的： 2、实验室条件：已具备的条件还不具备。 3、培养方法：1)培养基的选择(包括应补充的附加成分)和培养所需的其他液体2 )具体的操作方法和步骤(用实际的操作步骤表示)3)培养过程的观察注意事项4、目的细胞的鉴定方法：1)具体的方法(可举出13种)。 2 )应出现的结果：阳性阴性。 5、困难和解决办法：本工作作为成绩评定的依据之一，我的细胞培养计划(可以手写和印刷)，注意事项： 1，工作提交时间和地点：工作历史第16周(08.12.19 )前的地方： 104馆三楼(组织胚教室) 2，工作必须明确记载的项目：主题学名专业指导员

2、，本工作0771-5353538577 (创) e-mail:heshaoes2002，体外培养的基本原理和技术，一、体内的生存环境到体外生长条件，二、体外培养的基本方法和过程，三、体外培养物的生长生物学，四、细胞分离和纯化，五、细胞系(株)，细胞克隆，六，培养物的观从细胞分离和纯化、生物组织中分离出的细胞悬浊液和从动物体液中得到的细胞一般含有多种细胞成分，是异质的混合物。 体外细胞培养的目的不是研究特定细胞的特性、功能和其他特殊用途，所以必须获得与分离的细胞群尽可能均匀的细胞群。 进行体外细胞培养时，将要培养的组织材料分离(离散)成细胞(dissociated cell )，不仅作为细胞悬浊

3、液接种培养，而且从调制的细胞悬浊液中分离成分(separation or isolation )，尽可能将单一的细胞用于培养细胞分离(cell separation )是指将组织材料分散在细胞悬浊液中，从而得到目标细胞的过程。 (细胞分离是细胞成分，不是生化成分)。 细胞纯化强调了原代培养前从混合有成分的异质细胞悬浊液中或从培养物中得到单一类型的细胞的过程。 通过细胞的分离和纯化过程，培养物可以变成单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者可以成为细胞系(cell line )或细胞株。 四、细胞的分离和纯化、分离和纯化两概念之间没有明确的界限。 很多情况下，细胞的分离和纯化并不完全，

4、只能达到培养物中某些细胞为主的程度，因此也被称为浓缩(enrichment )。 细胞的分离和纯化过程不仅在原代培养之前进行，有时细胞的分离和纯化过程也贯穿原代和传代培养过程，甚至主要依赖培养过程来实现细胞的分离和纯化。 培养物中的细胞成分是否单一或目的细胞在培养物中的比例，常常是测定某一培养是否成功的重要指标。 四、细胞分离和纯化，可以根据分离纯化的对象和目的采用不同的细胞分离纯化方法，从简单的手工技术到自动控制特别是使用计算机控制的尖端机器。 从混有成分的细胞悬浊液中分离纯化不同的细胞，主要通过不同细胞具有的各种特性来实现，或者利用细胞的物理特性，例如密度、体积、电荷等，或者利用细胞的生物

5、学特性，例如特异的表面标记和功能。四、细胞分离和纯化、一.分离(分散)组织制备细胞悬浊液过程中的细胞分离、二.利用细胞体积和密度分离纯化的方法、三.利用细胞表面电荷的细胞分离方法、四.利用不同黏附特性的细胞分离方法、五.利用细胞表面标记分离纯化细胞的方法， 六、利用其他细胞学特性分离纯化细胞的方法，四、细胞分离和纯化1 .解离(分散)组织制备细胞悬浮液的过程中分离细胞，将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬浮液，接种培养是第一代培养最常见的方法。 从体内提取的许多组织(血液、骨髓、淋巴等少数结缔组织除外)是细胞与少量细胞间质(后者一般含有纤维成分)紧密结合的实体组织。 如果将采集的组织块

6、直接用于培养(这是植块培养)，培养的组织块超过1 mm3的话，在培养过程中只有植块周边的细胞得到营养而生存成长。 1 .分离(分散)组织调制细胞悬浊液过程中的细胞分离，由于被组织内部的纤维成分束缚，因此从植块内部能移动的细胞很少。 大部分植块内部细胞难以渗透营养物质和气体，缺乏营养和o-2供给，生长不良或死亡也是植块培养法长期体外培养困难的主要原因。 为了得到大量的细胞培养物，分离组织，解除组织块内部的细胞和细胞的“组织关系”，把细胞“释放”，变成分离(离散)的细胞的过程是细胞分离(离散)或分散(cell dissociation )。 细胞的分离(离散)和分散不等于细胞的分离和纯化，而细胞的

7、分散是细胞纯化的前提。 现在确立的在体外分离纯化细胞的方法，几乎都是从细胞悬浊液中分离纯化的。 把切下的组织制成细胞悬浊液，是细胞分离和精制的基础。 1 .分离(分散)组织制备细胞悬浊液过程中的细胞分离，如何用不同的机械分离和酶学分离方法在一定程度上分离纯化目标细胞？ 另一方面，可以根据采集组织的细胞构成，特别是细胞的大小进行分离纯化，另一方面，也可以通过根据组织不同细胞间质特性不同而实现。 每次培养接种，都要尽可能多的方法提高细胞悬浊液中目标细胞的比例。 为了达到这个目的，可以从以下步骤的进行中最大限度地得到目的细胞。 1 .解离(分散)组织制备细胞悬浊液过程中的细胞分离，(1)采访是体外培

8、养过程的开始。 正确的采访是获得某一特定培养对象的关键。 切割动物组织块时，请尽量去除附带的其他组织和残留构造。 (2)机械分离过程是机械分离采集的组织的过程，初步进行细胞分离纯化的手段之一是根据组织内的细胞的大小，用一定孔径的不锈钢或尼龙网过滤细胞。 1 )网络拾取法：2)细胞悬液过滤：1 .分离(分散)组织制备细胞悬液过程中的细胞分离，(3)用酶学方法分离纯化的酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是，根据组织不同，细胞和间质的构成也不同。 例如，上皮组织的细胞间质少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是胰蛋白酶。 结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分多。 消化结缔组织、肌肉组织的间质成分，

9、需要胶原酶和其他酶，胰蛋白酶的消化作用不明确。 (4)培养中的选择性分离在体外分散细胞培养中，培养本身具有自然纯化的特性。 1 )机械刮除：2)选择性酶消化法：1.解离(分散)组织制备细胞悬浊液过程中的细胞分离；2 .利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法；细胞可以视为完全颗粒，表现出相关的物理性状。不同种类细胞的物理性状可能互不相同，这些差异是部分或完全分离纯化细胞的依据之一。 基于物理性状的细胞分离纯化技术，因为不需要对细胞进行化学处理，也不需要像很多生物学方法那样抗原抗体、受体配体的相互作用，所以可以避免细胞的变化，这种技术具有独特的优势。 细胞分离纯化最常用的物理性状是细胞的体积(大小)

10、、密度、表面电荷。 利用细胞的体积和密度进行分离纯化的技术基于沉降作用。 不同种类的细胞通常具有不同的体积和密度，可以用沉降技术进行分离。 其基本原理是悬浊液中细胞的沉降率与细胞体积、细胞密度及其周围介质密度的差成正比。 应用沉降技术，沉降细胞的密度要大于介质，悬浮细胞的密度要小于介质。 因此，实施沉降技术分离纯化细胞的关键是选择密度梯度形成介质，沉降技术也称为密度梯度(离心)技术。 2、在利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法中，选择密度梯度形成介质的一般原则是：形成的溶液的密度包含必要的密度范围；形成的溶液粘度低；折射率等性质，因此可以测定其浓度(或密度)；不损伤细胞，不改变细胞的生物学特性

11、；离心根据上述原则选择，用于分离细胞的密度梯度形成介质有： (1)牛血清白蛋白(bovine serum albumin )， BSA) (2)聚蔗糖(polysucrose) (3)泛酸盐(4)硅胶颗粒，2 .利用细胞体积和密度分离纯化的方法(1)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)BSA为血清蛋白质，对细胞活性影响小虽然是早期采用连续或不连续的密度梯度分离细胞的最常见介质，但由于BSA粘度高，分离细胞必须长时间离心，使用量大，费用高，现在有一部分被其他分离介质取代。 (2)聚蔗糖(poly-sucrose )是合成蔗糖聚合物，商品名Ficoll，常用的是Mr40

12、0 000 Pa，Ficoll 400。 Ficoll不渗透到生物膜中，渗透压也小，不影响细胞活性和酶活性，但渗透毒性随着浓度的变化有指数增加的趋势，并且高浓度Ficoll溶液的粘度大，引起细胞聚集，所以低浓度Ficoll和其他物质，例如泛酸盐结合使用，提高了溶液的密度Ficoll 400是目前常用的细胞分离介质之一，商品含量为40%(w/V )，也可以用Ficoll干粉制备。 2、利用细胞体积和密度分离纯化的方法，2、利用细胞体积和密度分离纯化的方法，(3)泛酸盐泛酸盐离子强度低，能制备高密度低渗透毒性的溶液，且粘度小于Ficoll，适于按密度梯度分离细胞，与Ficoll并用在海外常用的商品

13、被称为Isopaque或Triasil (sodium metrizoate )和Hypaque (sodium diatrizoate )，与Ficoll配合的溶液商品名是ficoroll-isopaque(triosoil 代替国内常用的造影剂泛影葡萄糖(meglumini diatrizoici )，商品名为Urografin，含量通常为60%或75%，Ficoll和制备的溶液商品名为淋巴球分离液(上海试剂二厂)，密度为1.077士0.001 2、利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法，(4)用聚乙烯吡咯烷酮(PVP )涂复硅胶粒子，商品名为Percoll。Percoll具有稳定性高、可以

14、长期保存的优点密度稀释范围宽，可以包含很多哺乳动物细胞的密度溶液内产生的渗透压小，因此可以在全密度范围内保持均等粘度低，即使是最大密度也是如此， 在小的离心力和短时间内就能得到良好的分离效果细胞没有毒性，从细胞制剂中清洗除去容易高速离心(10，000r/min )时，可以形成连续密度梯度廉价，分离细胞时的使用量少。 因此，Percoll是一种优秀的分离介质，是目前分离许多哺乳动物细胞最常用的介质之一。 商品Percoll的密度一般为(1.13士0.005 )，2 .利用细胞的体积和密度进行分离纯化的方法，不同的细胞的分离方法：a .进一步密度梯度离心法，b .等密度梯度离心法，c .速度沉降法

15、，d .离心提取分离技术， 分离血球玫瑰轮细胞的分离连续BSA密度梯度非连续BSA密度梯度离心法连续Percoll密度梯度离心法非连续Percoll密度梯度离心法，分离低速离心速度沉降法单位重力沉降法单纯重力沉降法白血球和红血球的单纯重力沉降法分离颗粒球，2 .利用细胞体积和密度分离纯化的方法，a .一步密度梯度离心法：一将细胞悬浊液加入高密度介质，应用低速离心，密度比介质高的细胞通过介质沉淀在管底，密度比介质低的细胞滞留在介质上，体积大的细胞沉降快，体积小的细胞沉降慢，因此分离出不同密度和大小的细胞。 一步密度梯度离心法常用于分离形成血球和玫瑰环的淋巴细胞。 进一步密度梯度法常用的分离介质是

16、Ficoll-Hypaque，也可以利用Percoll、动物血清、BSA等。 2、利用细胞体积和密度分离纯化的方法、b .等密度梯度离心法、等密度梯度离心法分离细胞的依据是细胞的密度。 在等密度连续梯度分离中，细胞在强离心力的作用下，通过密度逐渐提高的介质沉降，当其达到某一沉降距离时，细胞的密度与梯度介质的密度正好相等，因此沉降速度为0。 不同密度的细胞组在梯度介质的不同位置形成带，因为细胞在这个特定的位置形成带带，而不会继续沉降。 因此，用等密度梯度离心法分离细胞只取决于细胞的密度。 相反，通过测定细胞滞留地梯度介质的密度，可以确定细胞的密度。 2、利用细胞体积和密度分离纯化的方法、b .等

17、密度梯度离心法、非连续密度梯度离心法，分离细胞的原理与连续密度梯度离心法相同，但细胞集中在介质和介质的界面上。 等密度梯度离心法采用强离心力，其目的只是加快达到平衡的速度和减少扩散的混合效果。 细胞体积的大小影响建立平衡的速度，但达到平衡时不影响细胞位于梯度上的位置。 应用本技术分离细胞的常用梯度介质是BSA和Percoll。 由于建立平衡的速度与介质的粘度成反比，所以使用Percoll等低粘度介质制成的密度梯度离心分离细胞可以在低离心力、短时间内实现平衡。 2、利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法、c .速度沉降法、速度沉降法中，细胞的体积和密度都影响细胞的分级分离，而细胞的体积是主要的决定因素。 细胞在单位重力下以低密度介质(约1.01 g/ml )沉降，或以低离心力(通常100 g )通过密度梯度层沉降，这种细胞分离方法即速度沉降。 前者称为单位重力沉降法，后者称为低速离心速度沉降法。2 .利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法，d