胶体金生产工艺配方原则

1、1、胶体金诊断试剂的工艺配方原则，2，内容，1，膜相关配方和原理，金垫相关配方和原理，样品垫相关配方和原理，相关问题，3，1，膜相关配方和原理，电子显微镜下的NC膜，4，硝酸纤维膜的工艺流程图，5，5 什么是结合力？ 静电疏水力这两个结合力的效果是什么？使蛋白质从溶液中分离的长期结合作用，10 )静电力是正负电荷相互吸引而产生的力，疏水力也被称为疏水结合。 这是侧链的疏水基相互接近形成的力。 在维持分子的三、四级结构上发挥着重要的作用。 各蛋白质具有疏水基和亲水基。 蛋白质的疏水性状和亲水性性状，在蛋白质溶解于溶剂中时，蛋白质处于非常稳定的状态，此时，蛋白质的亲水基向外扩展，疏水基收缩，亲水基

2、与水分子接触，确保溶解性的状态蛋白质沉淀后，疏水基扩展，亲水基收集12、蛋白质与固相材料结合，蛋白质与固相材料结合是因为蛋白质溶液扩散到固相表面的蛋白质从溶液中分离的蛋白质吸附在固相上的蛋白质为最低能量状态，13、吸附过程、溶液中的蛋白质、14、多部位结合、多部位结合使蛋白质稳定在固相表面， 其中每一个单位都是可逆的，但没有15、影响蛋白质结合的因素、蛋白质缓冲液所用的膜蛋白本身的应用体系、16、蛋白质缓冲液、通用缓冲液，不同的系统必须各自优化。 作用：提供适当的PH，改善亲水性、增溶性，提高稳定性规律：“蛋白在缓冲液中不稳定，蛋白结合力强”17，缓冲液的优化，离子强度对蛋白从溶液中脱离很重要

3、，少量离子强度，蛋白不易从溶液中脱离，在溶液制备中沉淀pH蛋白质在等电点最不稳定的沉淀剂通常用醇降低蛋白质的稳定性，也能润湿膜，减少膜带电的静电，有利于结合被复。 盐通常不影响某些蛋白质、两性离子的盐类，蛋白质键能减少信号强度，消除假阳，对18%，糖：被复蛋白质的稳定性起着重要作用，减慢老化速度，增加亲水力。 惰性蛋白：对去除假阳有重要作用的表面活性剂：能增加亲水力，使其增色。 19、缓冲液的基本成分，各种缓冲系： Tris-HCl、PB、CB等盐类： NaCl糖：蔗糖、海藻糖等表面活性剂： Tween20、Triton x-100等惰性蛋白质： Casein等防腐剂：叠氮化钠、卡推荐的开始缓

4、冲液10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol、21、“潜水艇”效果、使用用表面活性剂处理过的膜时的常见问题是，使用的表面活性剂为水溶性的喷雾膜时，由于这些表面活性剂“被冲走”，22、反应动力学、流速增加， 反应速度减少流速增加，检测时间缩短流速增加，灵敏度降低流速增加，试剂使用量增加流速增加，背景减少距离增加，流速减少孔径增加，蛋白结合量减少，23，2，金子垫相关的处方和原理，金子垫相关的技术和处方为：1)标记技术； 2 )金标稀释液3 )金垫处理液，24，标记工序，胶体金：一般指金的水溶液，也称为金溶胶。 -金是以微小的粒子分散在水中形成的金溶胶。 其中分散的金粒子的

5、直径一般在1100nm之间，为负电荷分布。25、高品质的结合物、单一分散粒子的圆形粒子凝聚少，由此得到的胶体稳定性和再现性好，26、胶体金的生产、胶体金的形成，HAuCl4. HAuCL4 e- Au0还原剂越强， 得到的金粒子越小，生产40nm的诊断用金粒子的是柠檬酸三钠、27、胶体金粒子的形成、28、胶体金的生产这两个重要步骤直接阶段性地形成的大多数人29、颗粒大小对胶体的影响，30、蛋白标记原理，蛋白质在等电点稍偏碱时，通过静电引力、疏水力及共价键牢固地吸附在胶体金颗粒表面。 蛋白质分子牢固地结合在金粒子的表面，形成蛋白质层，因此阻止胶体金粒子的相互接触，使该胶体溶液稳定。 31、点，蛋

6、白预处理使用低浓度和准确的pH值，最小的凝聚适当蛋白量(可以用盐滴定评价)、容器的清洁度、离心速度、32、盐滴定、盐滴定不能形成蛋白单层的盐滴定，是因为盐溶液中的蛋白量对胶体金的pH和时间稳定有影响33、蛋白粘合力电荷力(静电力)疏水力共价键、34、35、金标稀释液、适当的离子种和强度、0.2M左右、磷酸盐等常用。 作为高分子物质在胶体金干燥后均匀散布的骨架，常用PEG4000、PEG20000、PVP等高分子物质。 小分子物质保护蛋白质的活性，蛋白质储存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各种低聚糖等，有助于产品的储存稳定性。 36、惰性蛋白质，它能保护目标蛋白质的活性，还能维持胶体金的胶体稳定，它们

7、还具有去除非特异性封闭物质，分散胶体金粒子的骨架作用。 经常使用PS、PS、PS in。 表面活性剂具有提高亲水性、促进结合等作用。 常用的是Tween-20、Tritonx-100。 37、金标稀释液的参数，评价金的释放程度和速度。 金标液的稳定性。 灵敏度、特异性、38、结合物释放焊盘的原理、什么是结合物释放焊盘？ 孔径开放快速色谱低蛋白结合力理想的亲水性传统材料有包复PVA的玻璃纤维、39、典型的结合物释放垫材料的构想、40、侧方色谱中的结合物释放垫的原理、做什么(理论上)？ 将结合物完全干燥样品后，实际使用结合物的侧方色谱的结合物放出垫可能面临的问题比其他任何成分都多，41，标准结合物

8、放出垫的性能，45秒内放出了约70%的结合物， 焊盘上残留的结合物降低了灵敏度：少的结合物没有到达陷阱线的抗原到达陷阱线的侧方断层系中，灵敏度好的线CV值一般存储在15-20%、42、20oC中时的结合物放出率、43、金垫处理液、作用：增加亲水性2 )表面活性剂： Tween-20、Tritonx-100等。 3 )高分子物质： PEG4000、PEG20000、PVP、PVA 4)惰性蛋白质： BSA、OVA、Casein。 5 )小分子保护物质：糖类物质，如蔗糖、海藻糖等。44、结合物释放常见问题，释放不充分缓释垫的再湿润困难，45、释放不充分，结合物被结合在释放垫上的聚合物和表面活性剂封

9、闭的释放垫在储藏中，结合物凝聚控制封闭剂的使用量，控制溶液的离子强度，46、释放慢，你的释放垫怎么样？ 用了很多糖吗？试纸的各组有密切接触吗？ 47、释放垫再湿润困难，您使用的是哪种释放垫？亲水怎么关闭释放垫？48、3、关于样品垫的处方和原理、作用：改变样品PH，调节爬升速度，控制金标的释放，非特异性2 )表面活性剂： Tween-20、Tritonx-100等。 3 )高分子聚合物： PEG4000、PEG20000、PVP、PVA 4)惰性蛋白质： BSA、OVA、Casein。 5 )生物物质：小鼠IGg、抗红细胞抗体等。 49、血清样品垫要注意蠕升速度、背景、灵敏度的达到和假阳的消除。

10、 全血系样品垫1 )需要能去除红血球！ 2 )溶血也必须具有以下功能，不能妨碍样品分离。 在一定范围内不同的血液样品量灵敏度的达到和假阳的消除，50，尿系样品垫要注意交叉反应的消除。 51、影响抗原抗体反应的外部因素，电解质抗原与抗体结合后，在由亲水胶体转变为疏水胶体的过程中，如果电解质不参与，抗原抗体复合体表面的电荷就会失去，水合层被破坏，复合体凝聚，形成大块的凝聚和沉淀。 如果电解质不参加，就看不到反应。 为了促进沉淀物和凝聚物的形成，作为抗原和抗体的稀释液和反应液，经常使用O.85%氯化钠和各种缓冲液。 但是，如果电解质浓度过高，就会发生盐析现象。 52、酸碱度蛋白质具有两性电离性，因此

11、各自的蛋白质具有一定的等电点。 抗原抗体反应必须在适当的pH环境下进行，pH过高还是过低会影响抗原和抗体的理化性质。 抗原抗体反应一般以pH为69进行。 53、温度抗原抗体反应必须在适当的温度下进行，一般优选1540，最佳反应温度为37。 某些特殊的抗原抗体反应，对温度有特殊的要求。 例如，冷冻凝固素在4左右与红血球结合最好，在20以上反而解离。 54、反应时间越长，抗原抗体反应越充分，发色也越浓。 调整所有辅助材料的想法可以从抗原抗体反应的影响因素和辅助材料的成分性质来考虑。 55，4，相关问题，假阳问题假阴问题的稳定性问题上的问题，56，(一)假阳问题，未标记的金粒子(裸金)电荷作用疏水作

12、用硫醇类的存在(S-H结合作用)抗原抗体作用(内源性物质)抗凝固剂和防腐剂的影响其他原因，57，未标记的金粒子(裸金)，裸金聚集周围有大量负电荷，样品爬上金垫，随着裸金的奔跑，在t线位置仅接触带正电荷的蛋白质就发生反应，形成假阳线的解决方法：标记检测过程，BSA封闭，58，电荷作用，胶体金粒子带负电荷，带正电荷的蛋白质反应环境为酸性时会发生这种结合。 解决方法：改变pH和盐分、59、疏水作用、抗原抗体结合和胶体金结合需要疏水作用，反应环境中存在疏水物质时，容易与胶体金或抗原抗体在疏水作用下结合，产生假阳结果，如标本中的脂肪、细胞碎片、细菌等。 解决方法：用表面活性剂或亲水性聚合物处理。 60、

13、抗原抗体作用，此类作用以包含与标记材料/包复材料免疫反应的非目标物在内的其他物质的假阳结果为指标。常见药物交叉反应，如KET试剂检测美沙酮标本并显示阳性反应，还有美沙酮和KET材料发生交叉反应的SG试剂中的抗小鼠抗体反应等。 解决方法：向样品垫、金子垫和硝酸纤维素膜中加入相应的抗体，在t线前去除该物质。 61、血清检测中的具体非特异性反应物，约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，对检测结果有一定影响。 常见的干扰物质有风湿因子、补体、嗜异性抗体、好目标抗原自身抗体、医源性诱导抗小鼠Ig(s )抗体、交叉反应物质、其他物质等。 62、类风湿关节炎因子人血清中IgM、IgG型类风湿关节炎因子

14、(RF )与ELISA系统中捕获的抗体和酶标记二抗的FC段直接结合，引起假阳性。 解决此问题的方法是，(1)将完全的IgG置换为f (ab ) 2；(2)样品预先用热改性(63、10min)IgG的固相吸附剂处理(将热改性IgG加入样品稀释液中也是有效的)。 (3)检测抗原时，在样品稀释液中加入2-巯基乙醇等，分解RF。 63、补体在被复和标记过程中，当所使用抗体的FC段的补体Clq分子结合部位露出时，Clq将补体和抗体两者连接，容易引起假阳性现象。 解决方法是(用EDTA稀释标本(2)在53、10分钟加热血清使Clq失活。 64，好氧抗体人血清中含有可与啮齿类动物(如小鼠等) Ig(s )结

15、合的天然好氧抗体，标识为容易包容的抗体发生反应，引起假阳性。 解决办法可以在标本稀释液中加入过剩的动物Ig(s )，但添加量不足或亚类无效。 65、医源性诱导的抗小鼠Ig(s )抗体(异构化抗体的一种)在临床上正在开展的小鼠原性CD3等克隆抗体治疗，用放射性同位素标记小鼠原性抗体的影像诊断和靶向治疗等新技术，都有可能使一部分患者体内产生抗小鼠抗体，还有小鼠等的刺激。 解决方法是在测定抗原时，向标本中添加足够量的正常小鼠Ig(s )，克服上述原因引起的假阳性。 66、例： Sg是用双抗体三明治的方法测定的，包复材料和标记材料都是单克隆抗体，属于小鼠IGg的种类，人体经常与动物打交道，容易在体内产

16、生抗小鼠抗体、抗牛抗体等好氧抗体，这种好氧抗体导致产生假阳反应67、为了消除好氧抗体的影响，通过在样品垫上加入正常动物血清或纯化的小鼠IGg，在膜上喷洒小鼠IGg A射线，或在金上加入正常动物血清或纯化的小鼠IGg，在t射线前拒绝好氧抗体，去除这方面的假阳喜欢靶抗原的自身抗体、抗甲状腺球蛋白、胰岛素等喜欢靶抗原的自身抗体，有时可以与靶抗原结合形成复合体，用ELISA法阻碍抗原抗体的测定结果。 解决方法是在测定前用理化方法解离后再测定。 69、交叉反应物类地高辛、类AFP样物质等是与目标抗原交叉反应的物质。 用多抗测定抗原时对测定结果没有太大影响，用单克隆抗体测定抗原时，交叉抗原测定簇也是所用单克隆抗体的相对靶决定簇时，也会出现假阳性结果。 70、抗凝剂和防腐剂的影响、抗凝剂(肝素、EDTA、柠檬酸钠等)、防腐剂(NaN3等)对离子和蛋白活性的影响，可能导致假阳的发生。 71、其他因素、血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过高等都对胶体金的测定结果有干扰作用。 解决方法：使用