免疫标记技术及分析应用.ppt

1、a，1，1节免疫测定法2节免疫荧光技术3节免疫酶技术4节放射免疫测定法5节免疫胶体金标记技术，7章免疫标记技术及分析应用，a，2，荧光素，放射性同位素，酶，发光剂，胶体金或电子致密物质等作为示踪物，标记抗体或抗原的抗原抗体反应。免疫指示器技术第1节，a，3，荧光显微镜，射线仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定法等精密仪器，直接显微镜观察或自动测量实验结果。a，4，免疫标记技术，分类：免疫酶技术(ng)，放射免疫测定法(pg)，免疫荧光技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术，发光免疫测定法。特征：非常敏感，特别，快速，定性，定量，定位，a，5，免疫标记技术，a，6，通过标记抗体或抗原的抗原抗体反

2、应，提高免疫学诊断的敏感度，fluorescein 抗体或抗原标记为露西汀，然后与该抗原或抗体结合形成的免疫复合物可以在特定波长的光刺激下产生荧光，通过荧光探测器测量或定位检测到的抗原或抗体。 荧光表明存在标记抗体，也存在相应的抗原。a，9，a，10，抗体的路西法标记，标记原理：抗体蛋白的游离氨基和FITC的异硫氰在碱性溶液中形成硫卡维酰胺键，将抗体和FITC结合成荧光抗体。标记方法：搅拌法：适用于显示体积大、蛋白质含量高的抗体。标记时间短，荧光素量少，但具有非特异性染色。透析方法：适用于显示样品量少、蛋白质含量低的抗体。标记比较均匀，非特异性染色较低。FITC isothiocyanate

3、fluorescein、a、11、常用fluorescein、返回、a、12、a、13、玻璃fluorescein及其，a，16，荧光显微镜的种类透射式下落，a，17，荧光显微镜的结构，a，18，流式细胞术，a，19，荧光微，a，20，(1)直接荧光染色法优点：简单、快速、特异性高。缺点：灵敏度低。a，21，a，22，a，23，a，24，(2)将路西法显示在第二抗体(抗抗体)上，或显示在spa上，以检测与抗原结合的特定抗体的间接荧光染色。a，25，a，26，a，27，(3)补体荧光染色法在补体的抗体(抗c3抗体)上显示露西汀，并检测抗原抗体复合物。a，28，优点：可以检测所有抗原抗体系统，通用

4、性；灵敏度高。缺点：操作过程长，干扰因素多，非特异性荧光多，假体易停用，需要新鲜准备的不便。a，29，a，30，a，31，免疫酶技术，Enzyme Immunoassay(EIA)，iii，a，32，银抗原和抗体的特定免疫反应和酶的催化反应相结合，建立的免疫测定法，a，33，抗原抗体反应酶催化反应肉眼，光学显微镜，电镜，分光光度计特异性，敏感性可以在细胞或细胞级别追踪具有抗原或抗体的部位，也可以在g，甚至ng级别量化。，a，34，将酶分子与抗体或抗抗体分子共享结合，酶标记抗体可以存在于组织细胞中，也可以与吸附在固相载体上的抗原或抗体特异性结合。降低基质溶液，基质可以通过酶作用催化基质水解、氧化

5、或还原等反应，产生有色物质。酶解基质的数量与呈现的颜色成正比。a，35，优点：灵敏度高，特异性强；定性定量检测适合普查的可溶性抗原和抗体；试剂来源广，稳定，保存时间长，没有同位素污染。结果可以用肉眼半定量，用仪器定量测试，仪器价格低廉，可以在大部分实验室进行。操作方便，容易掌握和使用，重复性好。可用于组织细胞中寻找抗原或抗体成分。a，36，缺点：显示反应更难，操作中容易引起酶、抗原或抗体的停用。a，37，1，常用酶及其底物，酶活性高；抗原抗体共享结合组；标记后不影响酶活性及抗原，抗体反应性。产品很容易决定或测量。酶活性不受样品其他成分的影响(将酶标记抗原和抗体结合进行同质测定后，酶活性被抑制或

6、激活)。无害；无害。稳定、便宜、容易得到。常用酶底物色辣椒冷过氧化物酶o-苯二胺，H2O2橙色四甲基苯胺，H2O2蓝色碱性磷酸酶p硝基苯磷酸盐黄，a，38，a，39，2，标记方法，酶结合技术简单，产量高；不影响酶和抗体(抗原)的生物活性。结果酶标记稳定性；少形成酶和酶、抗体和抗体、抗原、抗原的聚合物。a，40，戊二醛交联方法：抗原-戊二醛-酶改良和碘酸钠标记方法：高碘酸钠氧化酶的羟基是醛基，与抗体蛋白的氨基相结合。HRP-CH2-NH-IgG，a，41，3，酶标记的纯化和鉴定，1，纯化玻璃酶：非特异性染色玻璃抗原(抗体):竞争性还原特定染色葡聚糖凝胶色谱50%饱和硫酸铵沉淀纯化，a， 48，E

7、LISA，a，49，Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA，Enzyme-linked immunosorbent assay，a，50 固相载体的特性：聚苯乙烯等固定相载体2。试剂的制备：所有试剂的制备均为双蒸汽水3 .封装：(1)炮击缓冲液：pH 9.6碳酸气缓冲液(2)炮击浓度： 10g/ml (3)炮击时间：4 或37 时1-3h (4)炮击量：11直接方法2。间接方法3。三明治法4。竞争法5。捕获方法，ELISA类型，a，56，1。直接方法，a，57，direct ELISA-for ag，a，58，Direct ELISA-for Ab，返回

8、，a，59，2。间接法、间接法是检测抗体的最常见方法，使用酶标记的抗抗体检测与固体结合的检测抗体，这称为间接法。，a，60，a，61，a，62，封装的固相载体：使用已知的抗原俘虏固定载体，检查对象标本：将该抗体与固定相抗原结合清除无关物质，将酶标记抗体3360与固定相载体抗原复合；清洗，去除未结合的酶标记抗抗体，基质标记，根据颜色反应程度，定性或定量测定该抗原，间接ELISA过程，a，63，3。三明治法：双抗体三明治法，双抗体三明治法是检测抗原的最常用方法，a，64，a，65，获取要分析的物质的未校准抗体，连接特定抗体和固相载体以形成固体抗体，去除未结合的抗体和杂质，添加封闭蛋白质溶液以运输彻

9、底清洗未结合的酶标准抗体，添加基质进行酶催化反应，根据颜色反应程度定性或定量测定抗体，双抗体夹心法，a，66，双抗原夹心法，补体，正在测试的抗体，标记抗原，标记抗原，标记抗原， 竞争法，a，69，a，70，竞争法的原理，固相支持体表面，测试对象，封装抗体，标记抗原，a，71，用已知的特定抗体封装固体载体，测量管和特定数量的酶标记抗原与固体抗体竞争，对照组仅添加特定数量的酶标记抗原与固体抗体直接结合，去除未结合的成分，添加底物颜色，分别测量两个管的吸光度值，按对照组和测量管吸光度值的比例计算标本中要测量的抗原含量，捕获方法，特定抗原的血清特定IgM往往与可能妨碍IgM抗体测定的特定IgG存在。因

10、此，IgM anti-ben多用途捕获法，a，73，被复体，试验抗原，补品，标记抗体，捕获抗体，特征：所有工具包都具有相同的补品和包装工艺，a，74，(洗涤。(2)添加稀释血清标本：绝热反应后，血清内IgM抗体被固相抗体捕获。去除其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。(3)添加特定抗原试剂：仅与高形状的特定IgM结合。洗涤。(4)添加对特定酶的抗体：与固定相结合的抗原反应相结合。洗涤。(5)增色：如果出现颜色，则是血清标本中有特定IgM抗体的阳性反应。捕获过程，a，75，食品中盐酸克伦特罗的测定食品中的毒素(主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素)食品中有害微生物的快速筛选(如沙门氏菌)，甲胺磷，农药检测

11、：a，77，ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒，ELISA在结缔组织疾病早期诊断中的应用检测抗异质性细胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿关节炎(PtA)33抗体，ELISA在疾病诊断中的应用 for the development of radioimmunoassays of peptide hormones ，veterans administration hospital Bronx，ny，USA b.1921，1921 是微观分析方法的突破。a，83，放射免疫技术，优点：特异性，即抗原抗体的特定反应；灵敏度高，结果准确，检测范围10-910-12g；操作过程简单，样品准备程序

12、简单，测量和数据处理自动化。样品使用少，一般不需要复杂的净化步骤。广泛应用领域，尤其是小分子hapten的测定。缺点：需要昂贵的测试设备。同位素污染。a，84，结合，自由相，a，85，免疫胶体金标记技术，第v，a，86节，胶体金标记技术，胶体金作为跟踪标记胶体金粒子表面带更多电荷，将抗体标记为胶体金粒子，在组织或细胞标本中检测抗原。a，87，胶体金由白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠、单宁酸等还原剂聚合成一定大小的金粒子，因静电而处于稳定的胶体状态，因此被称为胶体金。利用它在碱性环境中具有负电荷的特性，与蛋白质分子的正电荷被吸引到静电中，形成牢固的结合，除了抗体蛋白外，胶体金还可以与其他几种生物大分子结合。a，88，胶体金表面吸附的抗原或抗体可以将胶体金粒子输送到组织或细胞内、固相载体上相应的抗体、抗原的位置。金粒子具有高电子密度的特性，因此这些标记表示在抗原抗体反应中达到一定密度(即金粒子107/mm2)时肉眼可见的粉红色斑点。A，89，胶体金标记技术，