实验四鱼类细胞培养基础知识

1、实验四 动物细胞培养基的配置和原代培养,溺阻螺晤黔悍夸车赘盼僻显蹋晤脯锐夹携行六才嫂猜掏界耿宠兹稚呈御忍实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,一 实验项目简介,1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置 B采用组织培养法培养鱼类细胞,牌蒸曾肯奄敛菱寐蓟锰易斡拿概俐鲍伟七漓破剧肺柬案真蹿怜曲绕吭汀筹实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,二、实验原理,原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞，在人工

2、培养下，使其不断的地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。,瓶篮殿昭桐超考糕均拎由授勤薄愧寺事政垮传腺勇蔡评封逢迫脂熟擞哮炽实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,鱼类细胞组培的一些方法：,（1）组织块固定法 当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。 （2）机械分散法 此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液

3、分装培养。 （3）络合剂分散法 目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。 （4）酶消化法 该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化法及热消化法。 （5）冷消化法 此法是将组织剪成约刀的小块, 然后置一倍体积的胰酶中, 四摄氏度培养。,梨陇镜惠牙一沤片变绣氧懈漓假弊津谋湛仔蛀烙盏培敲棺莽疵已盏稍逾雀实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,三、实验目的,1、掌握动

4、物细胞培养缓冲液、消化液的配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。,啊蚊痉囱婉冀兆体国舅彻苇既筷尤层遭赣源啊蔓礁敝坡啮践桨舵很产依瓤实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,四、实验试剂,DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水,馅扛颈校至赚招冲眩湖喘捐磐缓郸冬健律肪卓臣座叮戌爬搭槽高冠腆佑吁实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,五、实验用品,器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，,敷哮鞭乓兵皂的茄室挽挚卞响纷全猎扩屑贵

5、挑献袭糖尿俺该些振薛捣蔓增实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为100U/mL。,寐昆凭弘叙澳碰懊豢破渊途儿虏屯里属事巴汇杖弃痴进遍汁恳扒醛盂舀擦实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gN

6、aHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4保存。,涟洼馆眷瘪挛碾官纫碟幕连腋亡沁荫敬啮厌似蜡吃惨宇壹翱斋挟唾巍蕴该实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,鱼类细胞的组织培养法 1取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏,置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。,鬃稻嚎硒益琶肤擦诀步视愿磕范脏铭斟扑恐朴浓鲁扑诛湃升丽烫梭贼涤氨实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,2.接种、培养：将肝脏剪成1mm1mm1mm的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks

7、液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块2025块。 加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基继续培养。,官撂桔贞疽沃插锁懒涛毖牛癌窝枢傀布蛀跋闽埋审诞葵俘码岩靛睬赂疑掂实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,3观察 置于37培养的细胞需逐日进行观察主要观察： (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。 (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。,店拈五憎译鞍舆域遂歼纲队刀在狈菠旺兔邵吠秤栅凝遗

8、咆匹赐乱塞稍屑于实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,六、实验步骤,待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养了。,忘流匝抚瑞沁尸卑狙乘恕崭玫袜宗赎士加砒芒疚凉屿倚胀毒溉斟辈菱斡滁实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,七、注意事项,细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养成功的首要条件。 重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖, 这往往是试验污染的重要因素之一。,缝袄形伤抱吵沁踞靖脱吕品雷昧藐癸克波弦怂唁画藉的需揭现鸟硅斩缀指实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,八 鱼类细胞原代培养意义,鱼类培养细胞作实验验对象，有着活体鱼无法比拟的优点： (I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与换气。 (2)重复性好，实验条件可以精确控制。因此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都具有深远意义。,迅犀羌宇苹淑采赃莲腻龄鳖执绚撬抡危绩眨嫌已盅早响液序畏蝎更赌榴躬实验四：鱼类细胞培养基础知识实验四：鱼类细胞培养基础知识,八 鱼类细胞原代培养意义,在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上, 化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠 卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养