二代测序技术在医学领域中的应用

1、二代测序技术在医学领域的应用，魏冬凯，概要，二代测序技术的介绍常见医学领域NGS方案石蜡包埋样品解决方案CTC和ctDNA，二代测序技术的介绍，人类基因组Human Genome， 30亿对碱源于母亲的30亿对碱源于父亲线粒体基因组的母亲和人类共生的微生物基因组，DNA的构成末端法测序，ABI 3700 (ABI 3730 )，人类基因组计划(HGP )，人类基因组计划(human genome project 美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参加了这个预算高达30亿美元的人类基因组计划。 根据这个计划的构想，最终必须解开人体内约4万个基因的密码，建立人类基因的光谱。 也就是说，必

2、须揭示构成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。 人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划合称为三大科学计划。 被称为生命科学的“月球着陆计划”。 Celera Genomics、Craig Venter成立的第一个使用所有基因组鸟枪法进行排序，使用330台ABI 3700，购买并计算当时世界排名第三的服务器，用3个月对Venter的基因组进行排序，2000 Ventor基因组序列分析必须根据分子克隆将DNA片段克隆到大肠杆菌中。 否则无法进行序列分析。 一次终止反应体系为10ul，其中含有1013个DNA分子，但一次只能测定一个。 预计要花2亿美元，最终要花30亿美元。如何减少试剂的消费

3、？ 减少消费的方法，1 .用聚合酶链反应(PCR )替换分子克隆，在DNA片段上加尾。 桥式PCR 2.降低反应体积，将测序反应放入小空间。 10ul的试剂有更多的DNA测序反应。 减少消费的方法，1 .用聚合酶链反应(PCR )替换分子克隆，在DNA片段上加尾。 桥式PCR 2.降低反应体积，将测序反应放入小空间。 10ul的试剂有更多的DNA测序反应。 桥接器PCR、第二代同步(NGS )、合成的同时同步(SBS )、流蜂窝、SBS技术的特征、读长初期只有31bp，现在已达到600bp。 随着运行时间的延长，荧光信号逐渐变弱。 一次只能结合一个碱基，发出荧光信号。 Hiseq 2500有高

4、通量模式和高速模式两种模式，可同时运行两张八频道流小区。 一次可以执行的数据量最大为500GB。 快速模式的最短运行时间是17小时。 常见医学领域的NGS方案、第二代定序应用医疗的可行性、NGS的优势在于，NGS比世代定序节省时间和成本、速度快、霸权度深， 高准确度的高通量测量序列人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因的疾病引起的基因突变，而高通量测量序列具有广泛的需求样本类型，可为患者医生提供准确的诊断依据，且对样本量的需求很少。 常见医学领域NGS方案、全基因组重排分析(WGRS )寻找个体突变、InDel、CNV、SV等，需求数据量大，单个样本需要90G的数据。 全外源组定序(WES

5、)对基因组中的全外源定序，定序的数据量远少于WGRS，可得到高定序深度(50X-150X )，是常见的医学区域NGS方案， 目标区域序列对感兴趣的目标区域进行序列排序，技术过程类似于所有外延序列，序列的需求量小于WES，且序列深度(最高500X )的转录组全基因组重排序是将基因组序列已知的个体进行基因组排序，并在个体或集团水平上进行差异分析的方法。 随着基因组测序成本的减少，人类疾病的病原突变研究从外显子地区扩大到全基因组范围。通过建立不同长度的插入片段文库与短序列、两末端序列相结合的策略，实现了在全基因组水平上检测疾病相关的常见低频、更少见的突变部位、结构变异等，具有重大的科学研究和产业价值

6、。全基因组重序列分析(WGRS/DNA-Seq )、SNP (个体间差异) CNV (大片段基因拷贝数变异) InDel SV (结构变异)、全基因组重序列分析的应用、SNP(SNV )，例如，为什么研究SNP？ SNP目前被公认为疾病发生的基因分子标记。 SNP被认为是导致药物差异的主要原因之一，可以根据SNP的变化进行个人化。 SNP分布广泛，稳定。 部分SNP直接影响功能基因的表达。 很多SNP没有用，很多SNP是沉默突变。 未编码区域的错误突变不会改变蛋白质。 但是，也有例外，诊断例： Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，使用MiSeqDx从危险少年的脑脊液中

7、提取核酸样品，测定8百万条核酸序列，从其中检测出475条钩端螺旋体的序列，该少年的病得到了证实Dr. James Gern基于上述判断，治疗了男青霉素，治好了该男子的病。 脑脊液是比较难得到的体液，只是采集量少，得到的核酸总量受到限制。 钩端螺旋体在病原体常见排名中是比较晚的种类。 本案例中，使用PCR法分别调查病原体时，有可能没有向钩端螺旋体排出，核酸不足。 但是，高通量测定序列克服了核酸量不足的问题。 本案例中，钩端螺旋体DNA仅占总DNA的万分之0.6，含量极少，但通过高通量测定序列得到475条钩端螺旋体的DNA，使钩端螺旋体循环。 2009年感染H1N1病毒时，死于呼吸系统的患者多器官

8、衰竭，但具体死因不详。 科学家把患者肺穿刺组织的DNA带来了高通量的测定序列。 最终在950万条序列中，0.85%的序列来源于H1N1病毒基因组，帮助科学家发现患者的真正死因。 在这种人基因组干涉的背景下，其他技术很难迅速发现病原病毒的序列和分子分类。 Kuroda、m .Katano、h .Nakajima、n .Tobiume、m .Ainai、a .Sekizuka、t .SATA、T. (2010). PloS One，5 (4) e 10256.doi 336010.1371 /。 nimblebleng (Roche ) sureselect (agilent ) rnaoligo

9、trusight 在WES应用领域，以低成本(一般也需要50-150X、8-15G的数据)降低分析背景，容易发现稀有的突变。 可以测定约50-80bp的片段缺损，因为外显子捕获芯片片段很短，很难判断是捕获脱靶还是缺损引起的。 同样，由于捕获芯片的片段很短，所以一般不进行CNV、SV的分析。 包括WES的特征、WES方案的流程、mRNA-Seq、lncRNA-Seq、sRNA-Seq等。 可以高吞吐量分析转录信息，发现未知转录和基因评论。 寻找个体间、同一个体的不同时期等，感兴趣的基因表达丰富度的变化。 转录组测序(RNA-Seq )、mRNA-Seq方案、lncRNA的一些知识：长度大于200

10、bp的蛋白质具有内含子区和外显子区非编码RNA调节基因表达的作用，对染色体结构的影响、RNA的加工修饰和稳定性的因此，近年来，RNA-seq序列分析的许多文章包括对lnccna的分析，发现了很多新的lnccna。lncRNA-Seq、sRNA-Seq、RNA-seq的优势不限于已知的基因组序列信息，应用于未知基因组序列的各种高通量转录组的研究与芯片技术相比，背景信号值低、没有检测上限，相对于基因表达谱非常有内参时，定量显示了高精度和再现性。 不需要克隆的步骤，操作简单，所需的样品量少，能够在单细胞级别进行表达频谱分析的通量高，比Tilling array和大规模EST序列成本低。 在RNA-s

11、eq的挑战、文库构建过程中，大片段的RNA必须被碎片化处理，并导入一定的偏压。 PCR引起表达量的变化。 大量短序列数据的匹配和连接很复杂，且重复和多匹配序列的精确定位存在明显的问题。 高等真核生物可变剪切和反式剪切的判定还有相当大的误差。 测序深度的确定会根据种子、器官、组织、时期而变化，很难直接计算统一的公式。 石蜡包埋样品解决方案、FFFE样品(石蜡包埋切片组织)、石蜡包埋技术(formalin-fixedandparrffin-embedded，FFEP )是目前临床上最常见的保存DNA的方法， 全世界医院宝贵的临床样品中有80%以上使用该技术保存，但由于该技术DNA被福尔马林浸泡，D

12、NA分子被交联和酶修饰，DNA存在不同宽度的分解。 样品量庞大，80%以上的临床样品用石蜡包埋保存了许多宝贵的临床样品，进行组织学、病理学研究，相关实验验证容易，为什么使用FFPE样品，提取困难，福尔马林处理后的DNA容易发生交联，提取的DNA量低通常，FFEP-5kb的分解程度与石蜡包埋的时间有关，FFPE-WES有很大的挑战，有同样的突变吗？ 目前不能用于WGRS，样品分解严重，对DNA复盖度有很大影响。 DNA的量太少，质量不好。 石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA的交联和损伤越大。 未用保护缓冲液处理的福尔马林的影响很大。 FFPE样本还有问题，CTCS和ctDNA、CTCS是什么？

13、CTCs(Circulating Tumor Cells )自发地或通过诊疗操作从实体肿瘤或转移灶释放出进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTCs是在肿瘤转移过程中生存于血液循环系统的肿瘤细胞，其生成被认为是肿瘤转移的必要前提。 CTCs研究的意义、CTCs研究的难点、CTCs与其他血细胞有明确的区别，不同的组织学类型和分子表型肿瘤没有分别表达不同的标志。 CTCs在外周血中很少，一般在106-107个白血球中只含有一个。无显着特异性，数量少，CTCs丰富，细胞形态丰富，微芯片，密度梯度离心，Plasma:血浆Mononuclear cell :单核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和肿瘤细胞) Ficoll :密度梯度液RBCs : CTCs鉴定流式细胞仪分析(flow cytometry FCM )、免疫细胞化学技术ICC (immunocytochemistry )能鉴定标本中的细胞抗原性和形态学特征，维持丰富的目标细胞的细胞形态，保持细胞活力。 ICC能与显色剂结合的单抗和以CTCs特异性结合后通过显色剂的显色来鉴定CTCs的技术，通过分析上皮细胞和肿瘤细胞的正常起源组织特异性基因候补的表达来检测CTC，灵敏度很高但坏死的癌细胞、