米曲霉的培养及蛋白质的分析

1、曲霉培养和蛋白质分析，一，实验目的，用固体三角瓶培养曲霉，掌握固体培养微生物的原理和技术，蛋白酶活性分析方法，二，实验原理，过程和方法，一，实验原理二，实验过程三，实验方法，一，实验原理，固体培养微生物，是我国传统发酵工业的广泛用于黄酒、白酒、酱油、味增类等领域。 固体培养法： (Solid state cultivation ) :主要有散曲法和块曲法。 部分黄酒用曲、红曲和酱油米曲培养为散曲法黄酒用曲和白酒用曲通常采用嵌段曲法。 固态弯曲设备：实验室主要用三角瓶或茄子瓶培养的种子的扩大培养是将蒸过的材料放入石版，接种后可以在温度和湿度控制的培养室培养，在工业上现在主要是厚层通风池制曲，旋转

2、式圆盘式固体培养装置试验性地普及，日本、台湾大规模化、机械化。 固体培养微生物：主要用于霉菌的培养，细菌和酵母菌也可采用该方法。 其主要优点是节能，没有废水污染。 单位体积的生产效率高。 在我国广泛使用的厚层通风固体法培养法中，空气一般不经除菌处理，培养环境也不能严格无菌化。 染菌问题没有根本解决。 本实验使用的曲霉的生长特性和菌落特征：曲霉(Aspergillus )属曲霉(Aspergillus )。 菌落最初由白、黄色且黄褐色变成淡绿色褐色，反面无色。 2、实验过程，对米曲霉种进行纯化(单菌落分离)，形成斜面，并将斜面菌种放入250ml三角瓶中制成种子曲，扩大培养(500ml )。 用水

3、溶液提取曲霉培养物，制造粗酶制剂，提取粗酶制剂并进行蛋白酶活性的测定。 3、实验方法、曲霉培养本实验可分为斜面种子培养和三角瓶培养两个阶段。 三角瓶培养物在工厂经常成为一级种子。 试管斜面培养基：豆浆浸出汁：加入豆浆粉100克、水500ml，浸泡4小时，煮沸34小时，用纱布自然过滤，取液，调整为5波的美度。 在100 ml豆浆中加入可溶性淀粉2克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸镁0.05克、硫酸铵0.05克、琼脂2克、自然pH。 或马铃薯培养基：向200g马铃薯葡萄糖20g琼脂15-20g中加入水，使其成为1000ml pH的ph。 曲霉培养基1 :面筋80g、小麦粉(或小麦粉) 20g、水80ml

4、； 曲霉培养基2、豆粕粉10g、面筋90g、水110ml； 充电厚度： 1cm左右灭菌： 120、30-60min； 三角瓶培养基的制备：接种及曲霉的培养条件：曲霉固体培养的主要控制条件：温度、湿度、进料量、基质水分含量。 固体培养前，原料的蒸熟和灭菌同时进行。 实验室一般用高压灭菌锅进行，但工厂里原料煮熟、灭菌和发酵是用不同的设备进行的。 这和液体发酵不同。 28-30，培养20小时后，菌丝体充满培养基，第一次摇瓶，放松培养基，每8小时检查一次，摇瓶。 培养时间通常为48-70小时。 三、实验机器、设备和材料、恒温培养箱和固体培养室、负压式超洁净台、显微镜、柜台、水浴锅、分光光度计、试管、茄

5、子瓶、平板和500ml三角瓶等。 曲霉种(酱油生产用曲霉)，四，实验分析项目和方法，一，曲霉培养效果测定：曲霉孢子数(显微镜观察)。 通常，每克孢子数达到100亿以上，2，干燥物质的重量减少的测定，干燥重量减少=发酵前的干燥重量发酵后的干燥重量，3，曲霉蛋白酶活性的测定，3.1原理(1)，林试剂碱性极不稳定，被还原成酚化合物后变成蓝色(2)，蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯基丙酸等)。(3)以酪蛋白为基质，与酶液反应，经过一定时间后，加入三氯乙酸，中止酶反应，沉淀剩馀的酪蛋白蛋白质，与水解物分离，过滤提取滤液。 用碳酸钠进行碱化，再加入林试剂使其发色，用分光光度计测定。 (

6、4)，蓝色反应的强弱与蛋白水解物的量成比例，水解物的量与酶活性成比例。 因此，可以从蓝反应的强弱推测蛋白酶的活力。 3.2试剂(1)林试剂是在2000ml的研磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO42H2O)100g、钼酸钠(NaMoO42H2O)25g、水700ml、85%磷酸50ml、浓盐酸1000ml 加入蒸馏水50ml，均匀去除冷凝器，加入几滴液体溴，煮沸l5min，排出残留溴，去除颜色，溶液必须呈黄色而不是绿色。 如果溶液中还有绿色，需要滴下溴液。 煮沸去除。 冷却后，定溶于1000ml。 过滤后放入茶色的瓶子里保存。 这个溶液将蒸馏水稀释两倍，制成稀释后的林试剂。 (2)0.4mol

7、/L三氯乙酸(TCA )溶液测65.4g三氯乙酸，确定容量直至达到1000ml。 (3)0.4mol/L碳酸钠溶液测量无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，决定容量至1000m1。 (4)加入4)0.05mol/L pH2.5乳酸钠缓冲液a液： 10.6g80-90%乳酸和蒸馏水，定容于1000ml。 b液：加入70%乳酸钠16克和蒸馏水，定容为1000ml。 将16ml液和1 ml b液稀释1倍后，ph2.5乳酸钠缓冲液变成0.05mol/l。 (5)2%酪蛋白溶液取酪蛋白2g，加入0.1mol/L氢氧化钠20ml，在水浴中加热使之溶解(根据需要用弱火煮沸)，然后用pH2.5乳酸钠缓冲液定容

8、于1000ml。 调制后请立即使用，或放入冰箱保存。 否则细菌容易繁殖，会引起变质。 调制酪蛋白溶液时，泡沫过多的话，可以加入12滴酒精来消泡。 3350酸性蛋白酶溶液的调制，必须加入乳酸23滴使其湿润。 (6)100g/m1酪氨酸溶液，用l05的烤箱恒重烤，正确测量0.1g酪氨酸，逐渐加入盐酸(HCl)0.1mol/l使其溶解，加入蒸馏水定容于100m1，其浓度为1000g/m1。 吸入10ml这种液体，用蒸馏水定容在100ml的话，就会变成100g/m1酪氨酸溶液。 调制这种溶液后也立即使用，或放入冰箱保存，以免细菌繁殖变质。 3.3操作顺序、3.3.1标准曲线的绘制、(1)根据表调制各种

9、浓度的酪氨酸溶液，(2)按照测定顺序取6根试管，按照表号吸引1ml不同浓度的酪氨酸，分别加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，进行稀释后的林试验摇动放入浴锅中，在40下保温发色20min，在波长660nm下测定吸光度。 一般测定3次，取平均值。 以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，制作标准曲线。 正确测量蛋白酶固体发酵的湿曲2g，蒸馏水10-20ml，在30下浸渍30小时，用滤纸过滤。 将滤液稀释到一定的倍数(优选将测定光密度设为0.2-0.4的范围)。 3.3.2酶液制备，取4个试管，分别加入稀释酶液1ml，其中一个为空白管，三个为平行试管，放入40水浴中预热3-5min。 在3根平行试管中

10、分别加入1ml的2%酪蛋白溶液，准确测量时间保温10min。 立即加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，用l5min后纸过滤。 分别加入1ml清洗液、0.4m碳酸钠溶液5ml，最后加入1ml苯酚试剂，均匀摇动，在40水浴中使20min发色。 在空白管中，首先加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，再加入l ml 2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。 以下操作与平行试管相同。 以空白管为对照，在680nm的波长下测定测光密度，取其平均值。 3.3.3测定，蛋白酶活性单元定义：在40、pH2.5下，将酪蛋白水解1分钟释放酪氨酸酶的酶量定义为蛋白酶单元。式中： k :标准曲线中OD值相当于1的酪氨酸的微克数OD :平行试管的平均光密度4 :试管中的反应液的总体积(毫升) 10 :反应10分钟n :稀释倍数w :曲的称量量(