质谱技术分析

1、第三章 质谱技术,Mass spectrumMS,内容：,第一节 质谱学基础 第二节 高效液相色谱质谱联用 第三节 生物质谱简介,第一节 质谱学基础,什么是质谱 质谱仪的基本结构 质谱仪的主要性能指标 质谱图及其判读,第二节 高效液相色谱质谱 (HPLC-API MS),HPLC-ESIMS(电喷雾电离) HPLC-APCI(大气压化学电离) HPLC-APPI(大气压光致电离) HPLCAPIMS方法开发,LCMS联用所面临的两大问题,液相色谱流动相的量比质谱所能忍受的量大得多。典型流量是1mL/min,气化后相当于气体流速1501200mL/min，而现代质谱只能忍受的气体流量只有120m

2、L/min； 液相色谱的研究对象是难挥发和热不稳定的化合物，这些化合物用常规电离方法是很难电离的。 关于LCMS的研究主要致力于解决上述两个问题。,LC/MS 电离技术的相对适用性,HPLC-ESIMS (电喷雾电离),检测器,喷雾室,离子阱,电喷雾电离源 API-Electrospray Ion Source,高电压装置,电喷雾电离离子形成的必要步骤,步骤 1 溶液中的电离 样品的pKa 溶液的pH 步骤 2 喷雾 表面张力和粘度 气动辅助 步骤 3 去溶剂 干燥气温度和流速 热容量，H vap 步骤 4 离子从溶液中解吸 溶解能 步骤 5 气相中的离子反应 质子亲合力 电荷交换,步骤 1在

3、溶液中如何产生离子？,离子种类 NH4+ PO4- 酸/碱化学性质 M - NH2 + 酸 M - NH3+ + 酸-（正离子检测） M - COOH + 碱 MCOO- + 碱+ （负离子检测） 缔合（对类似糖的中性物质） M + Na+ M - Na+ （碱金属，如20 mM 乙酸钠） 衍生化 形成离子或酸/碱产物,步骤 2气动辅助电喷雾产生带电液滴,含有约100,000电荷、直径2 m的带电溶剂液滴,由于溶剂组成或流速，气动喷雾减小了液滴的大小对粘度和表面张力的偏离,喷雾柱体、端板和毛细管上的场使液滴带电,步骤 3带电液滴的去溶剂,热干燥气体,加热的氮气蒸发了液滴，增加了电荷/体积比。R

4、ayleigh极限是带电液滴能够存在的最大 电荷/体积比 。当电荷超过这个极限时，发生库仑破裂。,液滴的Cont库仑分裂,Rayeigh破裂释放出较小的最终变成样品离子的液滴。,50-100 nm带电液滴包含100个电荷,这些液滴包含母体液滴中10-20%的电荷但仅仅2 %的质量。,步骤 4从溶液中解吸离子,当液滴的场强超过分析物在溶液中的溶解能时，离子解吸进入气相。,带电残余物,离子蒸发,蒸发,Rayleigh 极限,Coulomb 爆裂,蒸发,被分析离子,步骤 5气相中的离子反应,通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转移和电荷交换反应。这个高压区允许发生1000次离子/分子反

5、应。,质子转移: 气相质子转移反应使分子带电 M + NH4+ M+H+ + NH3,电喷雾喷雾室设置,样品 在溶液中为离子态: 儿茶酚胺、硫酸酯共轭物、丁基胺 有可诱导电离的化合物：甲醇 含杂原子的化合物：氨基甲酸酯类，苯并二氮杂草类 溶液中带多电荷：蛋白质、多肽、低聚核甘酸 溶液化学参数 流速 样品的 pK, 溶液 pH 溶液导电性 应避免的样品 尤其非极性的样品：PAHs, PCBs,电喷雾需考虑的问题,HPLC-APCI(大气压化学电离),APCI离子化机理,APCI离子化机理,气化 溶剂电离 电荷交换给分析物 N2 (从干燥气) + e- N2+ + 2e- N2+ + 2N2 N4

6、 + + N2 N4+ + H2O H2O + + 2N2 H2O + + H2O H3O+ + OH H3O+ + M M+H+ + H2O,APCI 离子源,电晕针,HPLC 流速 500L/min 雾化气压力 60 psig 干燥气温度 start with 350 C 干燥气流速 4 L/min 气化温度 随 FIA调节 帽电压 随 FIA调节 (2000-6000) 开始 2500 V 电晕电流 随 FIA调节 开始 25 A (neg) 或 4 A (pos),APCI 喷雾室的设置,样品 分子量和极性中等的化合物：PAHs, PCBs, 脂肪酸, 邻苯二甲酸酯类； 不含酸性和碱性

7、位点的化合物（碳氢化合物、醇、醛、酮和酯）； 含有杂原子的化合物：脲、苯并二氮杂草、氨基甲酸酯； 具有一定挥发性的化合物, 排除了分子量较大和极性较大的分子, 如蛋白质/多肽； 电喷雾响应不好的样品； 溶液化学参数 较ES对溶液化学作用不灵敏 较ES更耐大的流速 适用ES不宜的一些溶剂 应避免的样品 在气化过程中热不稳定的化合物,APCI 需考虑,电喷雾电离: 其电离过程通过电场产生带电液滴，接着样品离子通过离子蒸发后，进行质谱分析。适用于在溶液中为离子态或可诱导电离的化合物。适用于分子量较大和极性较大的分子, 如蛋白质/多肽； 大气压化学电离(APCI): 气相化学电离 (CI)过程中溶剂相

8、当于CI反应气来使样品电离。适用于分子量和极性中等的化合物和具有一定挥发性的化合物, 排除了分子量较大和极性较大的分子。,小 结,HPLCAPIMS方法开发,HPLCMS用途,成份确认或定性及半定量，如合成产物分析，FIA 无光谱吸收物质的定量 低含量和色谱未分离成份的测定，如杂质检查，SIM，LC条件优化 未知样品的分析，如中药分析，与DAD结合, Multi-channel data acquisition 大分子样品分析，pH至关重要,样品前处理 质谱检测条件 检测离子模式，离子化参数设定 液相色谱条件 ESI液质分析 APCI液质分析 样品导入方式 Infusion, HPLC, FI

9、A 柱后修饰技术,样品前处理,了解样品情况 种类 纯度或含量，溶解度，存储条件，挥发性， 热稳定性 分子结构，pK值，pI值 影响LC/MS分析的主要因素 盐 背景或基质成份(离子化) 浓度 ng/ml, dimer 真空度，溶剂雾化,质谱条件 - 离子源选择（1）,ESI 待测物无需有挥发性 热不稳定成份首选 离子在溶液中已形成 形成单电荷离子和多电荷离子 流速 500L/min,质谱条件 - 离子源选择（2）,ESI 在溶液中已是离子态 catacholamines, sulfate conjugates, quaternary amines 含杂原子化和物 carbamates, ben

10、zodiazepines 带多电荷成份 proteins, peptides, oligonucleotides 对APCI响应弱的物质,APCI 中等分子量和中等极性成份 PAHs, PCBs, fatty acids, phthalates, alcohols, aldehydes, ketones，etc. 含杂原子化和物 carbamates, benzodiazepines 对ESI响应弱的物质,质谱条件 - 离子模式选择,正离子ES模式： 适合于碱性样品，amines, amides, aminoacids, antibiotics，etc 有杂原子(N2 O2)可接受H+、Na+

11、、NH4+，如NH2、 N、 NH、CO、COOR pH N2) 可失去质子? COOH、SH、NO2 pH pK+2 可正可负: 比较灵敏度,质谱条件 - API参数设定,ESI For aqueous levels above 50%,APCI Good sensitivity at above 500l/min，* - 需优化,液相方法转为液质联用需要考虑：,- 色谱分离和待测物离子化 待测物的离子化能力 流动相及流速与质谱的匹配性 色谱柱与质谱的匹配性,色谱柱 流动相 流速,液相条件- 选择相应的色谱柱,液相条件- 色谱柱内径选择,ESI Flow rate: 1-1000l/min

12、1.0, 2.1, 3.0mm id 建议用 2.1mm 浓度相关 反相流动相,APCI Flow rate: 50-1500l/min 4.6, 3.0, 2.1mm id 建议用 4.6mm 浓度不相关，进样多，信号强 反相和正相流动相,液相条件- 色谱柱颗粒度选择,5m Particles 扫描模式 wider peak width 简单样品,3.5m or 3000,对目标预期分子量选择加合离子和参数,选择反卷积参数蛋白质分子量 3000,选择反卷积参数概要,点击反卷积质谱图（ Deconvolute - Mass Spectra ）在谱图中找到多电荷成分,反卷积,Results,点击反卷积查看（ Deconvolute - view ）得到结果的详细列表,反卷积查看结果,Detailed list,在反卷积电荷状态标尺（ deconvolution-charge state ruler ）下选择