卫生化学――紫外可见分光光度法

1、1,卫生化学,第四章 紫外-可见分光光度法,2,紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis）是光谱分析法中一种重要的、广泛应用的分析方法。 光谱分析法（spectroscopic analysis）：是指利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。,3,如原子吸收分光光度法,如原子发射光谱法,如紫外-可见、红外,如分子荧光分析法,4,紫外可见分光光度法是根据物质分子对紫外或可见光区电磁辐射的吸收特征和吸收程度建立起来的分析方法 紫外区波长 200400nm 可见区波长 400760n

2、m 特点 灵敏度、准确度高、操作简便快速、应用广泛,5,待测物质,6,第一节 概述,一、电磁辐射和电磁波谱 光属于电磁辐射，基本单位是光子，光子具有波粒二象性：,波动性,7,光的传播速度： c真空中光速2.99792458108 m/s n折射率，真空中为1 波长，单位：m,cm,mm,m,nm,（1=10-10 m） 频率，单位：赫兹(周)Hz 次/秒,8,光量子，具有能量： h普朗克(Planck)常数6.62610-34 Js 频率 E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1 eV= 1.60210-19 J,微粒性,9,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越

3、低)，光量子的能量越低。 单色光：具有相同能量(相同波长)的光。 混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起. 例如白光。,波粒二象性,射线 X 射线紫外光可见光红外光微波无线电波,电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱。,11,12,第二节 基本原理 1.紫外-可见吸收光谱的形成 当光通过气态、液态或固态的物质时，物质分子选择性吸收辐射，产生紫外-可见吸收光谱，又称为分子吸收光谱。,13,物质分子内部三种运动状态对应三种能级： 电子绕核运动（电子跃迁）电子能级E电 原子在平衡位置上振动振动能级E振 分子绕轴转动（分子转动）转动能级E转,14,电子基态,电子激发态,J3 J2 J1,J3 J2

4、 J1,J3 J2 J1,J3 J2 J1,J3 J2 J1,J3 J2 J1,15,物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，物质也只能选择性地吸收那些能量相当于该分子振动能变化Ev、转动能变化Er以及电子运动能量变化Ee的总和E的辐射。 由于各种物质分子内部结构的不同，分子的各种能级之间的间隔也互不相同，这样就决定了物质对不同波长光线的选择性吸收。,有色物质的不同颜色是由于吸收了不同波长的光 （互补光）所致。,17,2.分子吸收光谱及其特征,将不同波长的单色光依次通过一定的溶液，分别测出对各种波长的光的吸收程度（用A表示）。 以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图，所得的曲线称为吸收曲线（ab

5、sorption curve）或吸收光谱(absorption spectrum)。,18,吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh 末端吸收饱和-跃迁产生,A,19,20,（一）有机化合物的电子跃迁类型,二、紫外可见吸收光谱与分子结构的关系,21,按能量大小： * n * * n *,22,1. * 跃迁 饱和烃类（单键， 且都是键）吸收光能后多发生此类跃迁，此跃迁所需能量大，（大约350k j /mol键） 一般吸收150 nm 的光，属于远紫外区 （真空紫外区）,23,n* 跃迁 含有杂原子（O、N、S、X）的饱和烃衍生物，这些杂原子上的 n 电子向着* 跃迁。吸收波

6、长在200 nm左右,24,* 此跃迁所需能量小（约200kj/mol键）吸收波长为200nm 左右具有碳碳双键（三键）的化合物会发生此类跃迁 孤立的* 跃迁 吸收波长在160190nm左右. 如 CH2 = CH2 max=165nm =104 共轭双键的* 跃迁 由于 与 键之间相互作用形成离域键，使* 跃迁所需能量减小，而且共轭键越长所需能量越小 如丁二烯CH2=CH-CH =CH2 max=217nm,= 21000,25,n* 易发生在含有杂原子的不饱和基团中，如 C=O 、C=S 、N=N等化合物。这些杂原子都有未成键的孤电子对此类跃迁一般在近紫外区（200-400nm），但小，在

7、10100之间,26,1电荷迁移跃迁（亦称内 oxred 过程） 所谓迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁，过程见下：,吸收谱带较宽、吸收强度大、max104，是强吸收带。,电子接受体,电子接受体,电子给予体,电子给予体,电子接受体,电子给予体,（二）无机化合物的电子跃迁类型,27,2配位场跃迁 四、五周期中的过渡金属元素分别有3d和4d轨道，镧系锕系分别含有4f和5f轨道， 在配体存在下过渡元素五个能量相等的d轨道和镧、锕元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道及f轨道. 当它们吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁到高能态的d轨道

8、及f轨道上去。 一定要有配体的配位场作用.,28,1生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团 具n 电子和电子的基团 产生n *跃迁和 *跃迁 跃迁E较低 例： CC；CO；CN；NN,注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的 吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波 长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强,2助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团 有机物：连有杂原子的饱和基团 例：OH，OR，NH，NR2，X,5红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基） 或采用不同溶剂后 吸收峰位置向长波

9、方向的移动，叫红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）,32,三、光的吸收定律,（一）Lambert-Beer定律 一束单色光通过含吸光物质的溶液时,I0Ia + It + Ir Ia + It,由上式可知,I0不变，若 Ia则It,反之亦然,33,我们把： It I0 = T 称作透光率（度） T 100 = T% 称作百分透光率（度） T越大，表示溶液对光的吸收越少 T越小，表示溶液对光的吸收越多 常用吸光度来表示物质对光的吸收程度：,34,朗伯定律 (1760年) : A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的,吸光物质的c 一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。

10、 比尔定律(1852年): A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。,35,朗伯-比尔定律 式中：A：吸光度； T: 透射率； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的浓度，单位molL-1或gL-1； K：吸光系数 意义:当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液中吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.,36,值得注意的是： 透过率T与c或b之间的关系是指数函数关系 吸光度A与c或b之间是简单的正比例关系,T 10 A=10- Kb c,A-lgT -lg(It/I0)= K b c,37,应明确定律的

11、三个应用条件： 1）稀溶液（C0.01mol/L) 2）入射光为单色光 3）均匀介质，可以为固体、液体和气体 吸光度特性加和性： A总=A1+A2+A3+A4.,38,吸光系数（Absorptivity）,c -mol / L -摩尔吸光系数 L mol 1 cm -1,c-g / L a-吸光系数 L g 1 cm -1,c-g / 100 mL E1%1cm-比吸光系数 100mL g1 cm -1,表示方法,相互换算：,39,摩尔吸光系数,物理意义： 当一定波长的单色光通过浓度为1mol/L， 吸收池厚度为1cm的溶液时测得的吸光度。 入射波长不同， 不同 溶剂不同， 不同 物质性质不同

12、， 不同,可作为定性依据,在最大吸收波长max处，常以max表示 。,41,（二）偏离Beer定律的因素,偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面: 1）光学因素 2）与试样溶液有关的因素,42,1.光学因素,1）非单色光的影响： 非单色光指的是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以（中心吸收波长）为中心的一狭窄波长范围的复合光，对于带宽为（即图中的）的单色光，测得的吸光度一般小于处的真实吸光度值，从而产生负偏离。,43,2）杂散光的影响： 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。,若样品不吸收 IS 则（I0+

13、I s）（I+Is）I0I， 使A 若样品吸收 IS ，则反之，。,44,2. 溶液的物理及化学因素的影响,）溶液浓度的影响 Beer定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用； 假定只有在稀溶液(C 10-2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。,45,）体系（介质）不均匀的影响 根据定律的应用条件之三（即均匀介质），一般真溶液质点小，对光的散射不特别厉害，但混浊液散射比较突出。 胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体系产生的光散射会引起对朗伯-比耳定律的偏离。 解决的办法：用空白做对比。,46,第三节 紫外-可见分光光度计,一、分光光度计的主要部件,碘钨灯

14、,氘灯,单色器,参比池,样品池,光电倍增管,数据处理和仪器控制,47,白炽光源：如钨丝灯、碘钨灯(可见光区，3202500 nm) 气体放电光源：如氢弧灯（氢灯）、重氢灯（氘灯）(紫外区，180375 nm)、 氙灯（紫外、可见光区均可用作光源）,1. 光源（辐射源）,48,49,单色器,作用：将光源辐射的复合光按波的长短顺序色散为单色光 包括狭缝、准直镜、色散元件 1)狭缝 入口狭缝：限制杂散光的进入 出口狭缝：让色散后所需波长的光通过。 2）准直镜（透镜或反射镜） 把来自入口狭缝的发散光变成平行光 把来自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。,50,3）色散元件 常用的色散元件有三角棱镜和光栅

15、棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,51,光栅 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600，1200，2400条/mm )，利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 优点：波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,52,3吸收池,又名: 比色皿，用于盛待测及参比溶液 玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,53,4检测器,作用：是检测通过溶液后的透过光强度 （光信号，并把光信号转变成电信号） ）光电管,锑铯作阴极：紫敏（200625nm) 银氧化银：红敏（625 1000nm),54,）光电

16、倍增管（photomultiplier tube, PMT）,55,二、分光光度计的类型,56,单波长单光束分光光度计,57,特点： 结构简单、价格低廉 使用时来回拉动吸收池移动误差 比色池配对 受光源、检测器的波动影响 不能自动记录吸收光谱。,58,2单波长双光束分光光度计,59,60,特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差 比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响 可以自动扫描吸收光谱,61,双波长分光光度计,62,特点： 利用吸光度差值定量 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差 比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响,63,三种分光光度计的区别,第四节 分析条件的选择,一、溶剂选择

17、1.考虑溶剂的截止波长 截止波长：用1cm 光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度Al时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（截止波长）。,65,2.考虑溶剂的极性 溶剂的极性对物质的吸收峰位置的影响不同 当极性增加时， *的吸收峰发生长移（红移） n*的吸收峰发生短移（蓝移、紫移）,66,二、显色反应条件的选择 （一）显色反应及要求 1.显色反应 显色剂：能与无色物质生成有色物质的试剂 显色反应：将被测组分转变成有色物质的反应 常见的显色反应：配位、偶合、氧化还原反应,67,显色反应的要求

18、 灵敏度高，一般 104; 选择性好，干扰少； 对照性好：显色剂在测定波长处无明显吸收, max 60 nm; 反应生成的有色化合物组成恒定，稳定; 显色条件易于控制，重现性好,68,（二）显色反应条件的选择 显色剂的用量： M + R MR （待测物）（显色剂） （有色物）,69,.溶液的酸度 1）酸度对显色剂颜色的影响 许多有机显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸度改变时，显色剂本身就有颜色变化 2）酸度对显色反应的影响 ,70,(3)酸度对金属离子存在状态的影响 当被测离子是容易水解的金属离子时，若酸度低于某一限度，被测离子形成羟基配合物、多核羟基配合物、碱式盐或氢氧化物沉淀，不利于光度分

19、析。,71,3显色温度 当温度升高： （1）反应速度加快； （2）某些有色配合物发生分解或氧化还原反应； （3）使有色配合物的摩尔吸光系数改变,72,A,4显色时间 显色反应可能： 瞬间完成，长时间内保持不变； 迅速完成，但颜色逐渐减退； 需要一定时间才能完成。,73,.干扰的消除（样品成份较复杂时）,消除办法有： ）加入配合掩蔽剂 ）加入氧化剂或还原剂 ）选择适宜的显色条件，控制酸度 ）分离干扰离子,74,二、测量条件的选择,（一）测量波长的选择 1）max 吸光度大，灵敏度高 2）若max处有干扰，只能遵循“吸收大，干扰小”的原则，可选另一灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,75,（二）

20、吸光度读数范围的选择 光度误差：指的是读数误差为单位百分透光度（T% =1% ）时所引起的浓度相对误差（CC） 分光光度计的读数标尺：,76,由于T 与浓度c 不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差T引起的测量误差c/c不同。 其中：T为透光率读数误差 T 为透光率 大多数分光光度计的T在0.002 0.01 之间。,77,在用分光光度计进行比色测定时，最好控制在： 在 15%65% A 在 0.80.2 之内读数比较合适 而当36.8% ( T=0.368) A = 0.4343时，误差最小,78,（三）参比溶液(reference solution) 的选择 也称空白溶液(blank s

21、olution) ，作用是调节透光度为100%,吸光度 有下列几种，应合理选择： ）溶剂参比：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其他组分均无吸收时，可用纯溶剂作参比溶液，称为“溶剂空白”。,79,）试剂参比： 如果除待测组分外，显色剂和其它试剂在测定条件下也有吸收时，则取与测定试液时所用的显色剂和其它试剂作为参比溶液（只是不加待测组分） ）试样参比： 如果只是试样基体有色，而显色剂无色，并且也不与试样基体显色，则用不加显色剂的试样溶液作为参比溶液,80,）平行操作空白： 在测量波长下，干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时： 掩蔽被测组分，再加入显色剂,作参比. 加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,81,第五节 定性与定量分析,一、定性分析 1.定性鉴别的依据：光谱特征（光谱形状,吸收峰数目，吸收峰的波长位置，强度和吸收系数等） 2.定性分析方法缺陷： 只能定性分析化合物所具有的生色团与助色团； 光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重。,82,3.定性鉴别的方法：对比法 1）对比吸收光谱的一致性 同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较,83,2）对比吸收光谱的特征值,84,二、定量分析及应用示例 （一）定量分析方法 标准曲线法 前提：固定仪器和测定条件,85,例：芦丁含量测定 标液：分别移取0.02000mg/ml标样