动物组织切片的制作与染色

1、1,水产动物组织切片的制作与染色,2,一、实验目的,学习石蜡切片法 了解组织染色原理 掌握各组织器官的基本结构,3,组织切片标本,载玻片,盖玻片,组织,二、实验原理,4,二、实验原理,取材 固定 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 染色 封片,5,1.取材,根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。 种类： 部位：肝 年龄或发育阶段 是观察横切面还是纵切面？ 取材原则： 动作-快，轻，用力均匀 体积合适： 0.30.30.3 cm 刀要锋利 及时固定:编号, 注明采集时间、地点、名称、组织部位,6,2.固定,取材后应及时固定，编号，注明采集时间、地点、

2、名称、组织部位。 目的-保持原来的结构 固定液：波恩氏液 固定时间：48h左右 固定后的处理：将固定液换成70%乙醇作短期保存,7,单一固定液 复合固定液长处突出，短处抵消（Bouins）,8,固定组织时应注意： 保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。 组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。,9,水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮。它既能与水相混合，又能与透明剂相混

3、。 脱水的过程：70%80%90%（各1h） 95%95%100%100%（各20min） 脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但不能过度脱水（过久使组织变脆, 收缩）,3.脱水,10,4. 透明,二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。 替代品：水杨酸甲酯（30min），氯仿等。,11,将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，便于今后的

4、包理与切片（1h）。 浸蜡应在高于石蜡熔点3左右的温箱（60）中进行，以利石蜡浸入组织内。,5. 浸蜡,12,将液态石蜡缓缓倒入金属模具中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（约15 min）。,6. 包埋,13,7.切片,包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，附于小木块上,通常切片厚度为56um切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。,14,贴片与烤片,用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。 在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45温箱中干燥。,15,8. 染色（H.

5、E）,碱性染料，使细胞核等呈紫蓝色嗜碱性,酸性染料，使一般胞质和胶原纤维呈粉红色 嗜酸性,苏木精（hematoxylin）,伊红（eosin）,16,染色液配制,17,9. 封片,染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。 二甲苯透明后，滴加适量（12滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。,18,三、实验主要仪器,切片机,烤片机,摊片机,19,四、实验试剂,Bouin氏液：饱和苦味酸 75 ml,甲醛 25 ml，冰乙酸 5 ml。 Ehrilich氏酸性苏木素液：苏木素

6、 2 g，纯酒精 100 ml，钾明矾 15 g，蒸馏水 100 ml，甘油 100 ml，冰醋酸 10 ml 1%伊红染液：中性曙红 0.51 g，蒸馏水 100 ml 1%盐酸-酒精分化液：浓盐酸 1 ml，70%酒精 99 ml 。 梯度酒精：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。 二甲苯 石蜡 中性树胶,20,五、实验步骤,（1）取材,21,取材固定（24-36 h） 70%乙醇（1 h） 80%乙醇（1 h） 90%乙醇（1 h） 95%乙醇（20min*2） 100%乙醇（20min*2） 水杨酸甲酯（约30min ）,1/2石蜡 + 1/2二甲苯（20min）

7、 蜡杯 （20min*2） 包埋 切片 贴片 烤片,（2）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,22,（3）H.E.染色流程,二甲苯脱蜡（1）（10 min） 二甲苯脱蜡(2)（5 min） 1/2 100%乙醇 + 1/2 二甲苯（1）（3 min） 100%乙醇（2 min） 95%乙醇（2 min） 80%乙醇（2 min） 70%乙醇（2 min） 蒸馏水洗（3 min）吸水,苏木精染色（14min） 自来水洗（10min） 分化液分化（3s） 自来水洗（35 min） 伊红染色（1.5min） 70%乙醇 （2 min） 80%乙醇（2 min） 90%乙醇（2 min） 95%乙醇 (1)(2)（2 min） 100%