中药有效部位分离纯化新技术.ppt

1、中药有效部位分离 纯化新技术 大孔吸附树脂吸附分离技术,2010年度全国执业药师继续教育教材 广州中医药大学 李庆国,中药有效成分或有效部位的提取分离与纯化，是中药现代化的关键技术之一。 大孔吸附树脂吸附分离技术是采用大孔吸附树脂，通过物理吸附从中药及其复方提取液中有选择性地吸附其中的有效部分，去除无效部分的一种提取纯化的新工艺。 汉方药广泛应用大孔树脂工艺，且已有“药用标准”大孔树脂。,一、大孔吸附树脂简介,大孔吸附树脂 ( Macroporous Adsorption Resin ) 是20世纪60年代发展起来的，是一类没有可解离基团，具有多孔结构（20-60目），不溶于水的固体高分子物质

2、。它具有选择性好、吸附性强、吸附速度快、机械强度高、再生处理方便等特点。 大孔树脂吸附分离技术的核心是吸附树脂的性能及其应用工艺。,1组成与结构 大孔吸附树脂主要以苯乙烯、二乙烯苯等为原料，在0.5的明胶溶液中，加入一定比例的致孔剂聚合而成。其中，苯乙烯为聚合单体，二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯等作为致孔剂，他们互相交联聚合形成了大孔吸附树脂的多孔骨架结构。致孔剂有石蜡、溶剂汽油、煤油、碳醇、聚乙烯醇等。,大孔树脂电镜照片,比表面积：大孔吸附树脂单位质量的表面积即为比表面积，一般以m2g表示。比表面积一般可达5001000m2g，具有良好吸附性能。 孔容：也称孔体积，指单位质量大孔树脂孔的总体

3、积，以mlg表示。大孔吸附树脂的孔容一般为0.51.1mlg。 孔径：大孔树脂的平均孔径。,2. 吸附原理与性能 物理吸附：范德华力，吸附热小，吸附速率快， 化学吸附：化学键合，吸附热大； 基本原理：选择性吸附,大孔吸附树脂的性能包括许多方面，如对溶液中的溶质的吸附量、吸附率、吸附速度、吸附选择性、脱附性能等。可以通过对比上柱量、比吸附量、比洗脱量、保留率、纯度等树脂吸附特性参数的测定与计算来评价大孔吸附树脂分离纯化的效果、质量与效益。,比上柱量：达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和。用于评价树脂吸附、承载能力。比上柱量越大，承载能力越强，是确定树脂用量的关键参数。计算公式为： S（

4、M上M残）W 其中M上为上柱溶液中指标成分的质量（上柱溶液体积指标成分浓度）；或以上柱溶液相当于药材质量表示，则为上柱溶液体积与单位体积浸出液相当于药材质量的乘积。M残为过柱流出液中指标成分的质量（过柱流出液体积指标成分浓度）。W为干树脂重量。,比吸附量：单位质量干树脂吸附成分的总和。表示树脂的真实吸附能力，比吸附量越大，吸附能力越强，是选择树脂种类、评价树脂再生效果的重要参数。计算公式为： Q（M上M残M水洗）W 其中M上、M残同上，M水洗为上柱结束，最初用水洗脱下来的指标成分的质量（水洗液体积指标成分浓度）。W为干树脂重量。 比吸附量的计算也可采用下面的公式： Q（C0Cr）VW 其中C0

5、为指标成分起始浓度，Cr为指标成分剩余浓度，V为溶液体积，W为干树脂重量。,吸附率：用于评价树脂对待分离组分的吸附能力。是选择树脂种类、评价吸附工艺优劣的参数。计算公式为： A（C0Cr）C0100 其中A为吸附率，C0为起始浓度（mgml ），Cr为剩余浓度（mgml）。,比洗脱量：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量。用于评价树脂的解吸附能力及洗脱溶剂的洗脱能力。比洗脱量越大，表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力越强，是选择树脂种类及洗脱溶剂的重要参数。计算公式为： EM洗脱W 其中M洗脱为用洗脱溶剂洗脱出的指标成分的质量（洗脱液体积指标成分浓度）； W为干

6、树脂重量。,保留率：用于评价树脂纯化的效果、范围、质量和效益。计算公式为： RM洗脱M上100 其中M洗脱、M上同上。 纯度：用于评价树脂纯化的效果、范围、质量和效益。计算公式为： P=M成分M总团体100 其中M成分同上，M总固体为用洗脱溶剂洗脱出的洗脱物总量。,大孔吸附树脂按其化学结构，即根据骨架材料是否带功能基团，可分为非极性、中等极性、极性和强极性四种类型。,3类型与规格,非极性大孔吸附树脂：一般是指电荷分布均匀，在分子水平上不存在正负电荷相对集中的极性基团的树脂，大部分为苯乙烯、二乙烯苯聚合物。 中等极性大孔吸附树脂：此类树脂内存在酯基一类的极性基团，具有一定的极性。常见的是聚丙烯酸

7、酯型聚合物，以多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂。,聚苯乙烯合成吸附树脂: 吸附含有电子的化合物, 如含有苯环和共轭双键的化合物。 甲基丙烯酸酯类吸附树脂: 吸附含有羧基, 酯基, 氨基, 酰胺基等与H可结合的官能团的化合物。 溴代聚苯乙烯吸附树脂: 吸附浓度非常低的具有有机取代基团的高疏水性物质。,表131 国外主要大孔吸附树脂性能表,表132 国内主要大孔吸附树脂性能表,4质量要求和质量评价 药用大孔吸附树脂的质量标准应包括名称、牌（型）号、结构（包括聚合单体、交联剂、致孔剂）、外观性状、极性，粒径范围、含水量、湿密度（真密度、视密度）、干密度（表观密度、骨架密度）、比表面积、平均孔径、孔容

8、（孔体积）、孔度（孔隙率）、刚性、溶胀系数（水乙醇）等物理参数，未聚合单体、交联剂、致孔剂等添加剂残留量限度等参数，主要用途、该质量标准的级别、贮藏及相关批准文号等。,药用大孔吸附树脂的使用说明书应包括以下内容：,（1）树脂性能简介。 （2）主要添加剂种类与名称。 （3）树脂残留物总量限量及检查方法，未聚合单体、交联剂、致孔剂等主要添加剂残留量控制方法及限量检查方法。,（4）树脂安全性动物试验资料，包括树脂及其粉碎物、预处理前后洗脱溶剂浓缩液等的急性毒性试验、长期毒性试验结果，或其他能证明其安全性的试验资料。 （5）使用注意事项、可能出现的异常情况的处理方法。 （6）树脂的预处理、吸附、洗脱、

9、再生、贮存方法。 （7）树脂有效使用期。 （8）生产厂家及生产许可证。,目前市售的大孔吸附树脂中大都含有未聚合的单体、交联剂、致孔剂、分散剂及防腐剂等。这些有机物可能会在生产过程中带入药品而影响人体健康。因此根据大孔吸附树脂的结构、组成、性能和适用范围，建立适宜的质量评价标准及方法是十分必要的。质量评价的标准及方法应包括以下两方面的内容。,树脂残留物检查 应对树脂中未聚合的单体和交联剂、致孔剂、分散剂、防腐剂等各种添加剂的残留物总量进行检查，建立树脂残留物及裂解产物的检测方法，并制订合理的限度。 苯乙烯骨架型大孔吸附树脂残留物检查项目暂定为：苯2mg/kg(ppm)、甲苯890mg/kg、 二

10、甲苯2170mg/kg、苯乙烯、烷烃类二乙基类及树脂残留物总量检查：其限量不能高于国家标准或国际通用标准。,表：某树脂的各项技术指标,残留物：苯2ppm， 其他20ppm.,安全性试验 苯乙烯型大孔吸附树脂稳定性较高，目前暂不要求进行动物安全性考察。但须根据树脂残留物可能产生的毒性反应，在做药物成品的毒理学试验时，适当延长观察周期，增加观察项目与指标，如神经系统、骨髓、肝肾功能等生化指标。同时对定型产品抽样进行安全性动物试验，以保证产品的安全性符合药用要求 动物急性经口毒性：LD505000mg/kg（体重） 动物急性经皮毒性：LD505000mg/kg（体重）,5预处理 商品大孔吸附树脂在出

11、厂前一般未进行彻底清洗，含有较多的未聚合单体与交联剂、致孔剂、分散剂、防腐剂等各种有机残留物。如果直接使用，会影响药品的质量和安全，因此在使用前必须进行预处理，以去除树脂所含的杂质，提高树脂洁净度。预处理的溶剂可以选择乙醇、丙酮、异丙醇、25盐酸或 25氢氧化钠等。,（1）渗漉法 采用玻璃或不锈钢色谱柱（径高比为1:31:7），湿法装柱。洗脱溶剂为乙醇25盐酸25氢氧化钠水，具体操作为：乙醇浸泡12小时2倍树脂体积（2BV，下同）洗脱浸泡35小时2BV洗脱浸泡35小时35BV洗脱浸泡35小时35BV洗脱23BV盐酸浸泡24小时洗脱水洗脱23BV氢氧化钠浸泡24小时洗脱水洗脱。,在用乙醇浸泡树脂

12、前，也可先用水进行反洗，使树脂层松散、展开，将树脂的微细粉末及一些机械杂质洗去，然后放出水，再加乙醇浸泡。若大孔吸附树脂因长期存放变干，或要求更严格的清洗，可用水乙醇甲苯乙醇水依次洗脱，这样不仅能洗出有机杂质，还可洗出线型聚合物。对于变干缩孔的吸附树脂还能使其孔结构恢复至最佳状态。,（2）回流提取法 大孔吸附树脂加丙酮或甲醇浸泡24小时，加热回流提取（或用改良索氏提取器加热洗脱），视树脂中可溶性杂质的多寡，一般需34天，甚至长达78天。,6再生 大孔吸附树脂使用一定周期后，吸附能力降低，需要强化再生。树脂再生用的溶剂可以选择乙醇（5095）、甲醇（50100）、异丙醇、丙酮（50100）、碱性

13、乙醇溶液、25盐酸和25氢氧化钠，洗脱方法可以选择正洗脱，也可选择逆流洗脱。若树脂污染不严重，一般用95 乙醇洗脱至无色止，树脂即已再生，用大量水洗去乙醇，可用于相同样品的分离纯化。若树脂污染严重，颜色较深，则需用酸碱强化再生。具体方法为用35盐酸浸泡树脂24小时34BV 35盐酸洗脱水洗脱至流出液呈中性35氢氧化钠浸泡树脂24小时34BV 35氢氧化钠洗脱水洗脱至流出液呈中性。,树脂经多次使用，柱上方沉积有悬浮不溶物，或柱床挤压过紧，或树脂颗粒破碎，都会影响流速，此时可选择逆流洗脱方法，用水或醇从柱下进行反洗，以便使柱床变松，悬浮不溶物或树脂破碎颗粒从柱上方被顶出。也可自柱中取出树脂，用水漂

14、洗，除去悬浮不溶物或树脂破碎颗粒，再重新装柱使用。 对纯化同一品种的树脂，当其吸附容量下降30以上时，则应视为不宜再使用。,7 保存 大孔吸附树脂应在0以上保存，因商品树脂含水量约在70左右，温度低于0，会使球体胀裂，破坏强度。,二、大孔吸附树脂吸附分离技术基本操作程序 1、根据待分离组分或部位的理化性质，筛选出适宜的树脂。 2、树脂预处理树脂吸附树脂解吸附（树脂洗脱）树脂再生。 树脂选择孔吸附树脂吸附分离技术的核心问题,1树脂筛选 大孔吸附树脂对物质的分离纯化取决于它的吸附性和分子筛性。吸附性的大小又取决于树脂的极性和被分离组分的极性，分子筛性则取决于树脂本身的多孔性结构和待分离组分的分子大

15、小。因此，树脂本身的极性大小与孔结构对待分离组分的选择性吸附是非常重要的。,吸附性：大孔吸附树脂对物质的吸附遵从类似物吸附类似物的原则，即极性大的树脂对极性大的组分吸附性强，对极性小的组分吸附力弱，反之亦然。,表134 10种大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附量（20，mg/g）,由表134可见，极性的 S-8 树脂与弱极性的 AB-8 树脂对银杏叶黄酮吸附量大，而非极性的 H107 树脂吸附量小。这是由于银杏叶黄酮具有多酚结构和糖甙链，具有一定的极性和亲水性，生成氢键的能力较强，有利于弱极性和极性树脂的吸附。对于非极性树脂，即使有较大孔径（如X5），对黄酮的吸附量也偏小。,分子筛性：有机物通过树

16、脂的网孔扩散到树脂网孔内表面而被吸附，树脂孔径大小直接影响不同大小分子的自由出入，从而使树脂吸附具有一定的选择性。树脂吸附能力大小与树脂孔径大小、组分分子大小密切相关。分子较大的组分宜选择较大孔径的树脂，否则将直接影响到分离效果。,在树脂孔径适合条件下，树脂的吸附量随比表面积的增大而增大，如NKA9树脂孔径为15.516.5nm，虽然与AB8树脂接近，但由于比表面积显著小于AB8树脂（ NKA9树脂的比表面积为250290m2g，AB8树脂的比表面积为480520 m2g），其吸附量显著小于AB8树脂。孔容的大小直接影响树脂的体积比表面积（每 l ml湿树脂所具有的表面积），在实际应用中，体积

17、比表面积对吸附量起着重要作用，树脂孔体积增大会引起体积比表面积下降，反而使吸附量降低。,大孔吸附树脂的性能包括许多方面。在实际应用工艺中，对树脂性能的要求往往是全面的，任何一项性能的缺陷都可能成为应用工艺成败的关键。因此在选择树脂时，必须综合考虑树脂的极性、孔径、比表面积、孔容等性能参数，以及对待分离组分或部位的吸附量、吸附率、吸附速度、吸附选择性和解吸率等。实际应用时，可以通过对树脂比上柱量、比吸附量、比洗脱量、保留率、纯度等反映树脂吸附特性的参数测定与综合评价，来选择适当的大孔吸附树脂用于组分或部位的分离纯化。,2树脂吸附 2.1 吸附方式 大孔吸附树脂的吸附方式可分为静态吸附与动态吸附两

18、种。 静态吸附可在带搅拌的釜和槽中进行。溶液黏度较大，悬浮物较多时可用此法。、适当的搅拌，可以提高吸附速度。,动态吸附多在不锈钢或搪瓷柱中进行，柱下部或上、下部装有80目的滤网。实验室则常用玻璃柱。将树脂装在层析柱中，是固定的，药液是流动的，因而被称为动态吸附。在动态吸附中，树脂床因装填的不均匀性、气泡、壁效应或沟流的存在，吸附饱和层面的下移常是不整齐的，即存在所谓“偏流”现象。并且当吸附过程临近结束，部分组分从柱子漏出时，柱子底部的树脂层尚未达到吸附平衡，因此动态吸附时，树脂的吸附容量可能会有些变化。,2.2 吸附动力学和吸附速率 Langmuir 方程：,Freundlich 方程：,qm

19、表示吸附剂表面被吸附质盖满时的饱和吸附量,N表示温度常数，其值越大，吸附过程就越容易进行。,23 吸附树脂柱 纯化水湿法装柱，防止因为壁效应或沟流存在，出现“偏流”现象，导致泄露点提前，吸附容量降低。 树脂柱径高比（树脂柱内径与树脂床高度的比值），一般可控制在1：37。,24 待吸附样品 1. 待吸附样品一般需配置成一定浓度的水溶液上样。水溶液上样前一般需经过滤或离心，除去较多的悬浮颗粒杂质。 2.鞣质、蛋白质、多糖等大分子物质及许多微粒、亚微粒等，易引起大孔树脂的毒化，导致吸附能力下降 3. 采用陶瓷膜微滤技术对样品溶液进行预处理,表135 样品预处理方法对银杏叶黄酮解吸附的影响,样品溶液的

20、浓度、pH值、离子强度、温度等对大孔吸附树脂的吸附性能均有不同程度的影响，需针对不同样品，通过试验研究，选择合适的条件。,2.4.1 浓度 在一定浓度范围内，大孔吸附树脂的吸附量随样品溶液浓度的增加而增大。但样品溶液浓度的增加有一定的限度， 随着样品溶液浓度的增加，树脂的泄露点会明显提前，导致计算出的树脂比吸附量降低。分离纯化中药样品时，以较低浓度进行吸附较为有利。,表136 茶多酚浓度对NKA9吸附性能的影响,2.4.2 pH值 酸性化合物在酸性溶液中进行吸附，碱性化合物在碱性溶液中进行吸附较为合适，中性化合物可在近中性的情况下被吸附.,表137 pH值对银杏叶黄酮吸附性的影响,2.4.3

21、离子强度 在样品溶液中加入适量无机盐（如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等），提高其离子强度，降低样品组分在溶液中的溶解度，就能够使树脂的吸附量增大。同时离子强度的增加，还能加快树脂对样品组分的吸附速度。,用D101和LD601树脂吸附人参总皂音时，在提取液中加入35的无机盐，不仅能加快树脂对人参皂苷的吸附速度，而且吸附容量明显增大。这是由于加入无机盐，降低了人参皂苷在水中的溶解度(降低水中的分配系数），使人参皂苷更易被树脂吸附。,244 温度 对于一定的吸附体系，温度过低，吸附过程往往在短时间内达不到平衡，升高温度有利于吸附量的提高。但同时吸附反应又是一个放热反应，温度过高，解吸速率加大，反而不利于吸

22、附。实验证明，在室温范围内（2040），温度对树脂的吸附量影响较小，但温度超过50时，比吸附量会明显下降。用LD605树脂吸附黄连生物碱的研究表明，树脂在50时的比吸附量仅为20的70左右。,25 吸附流速 对同一浓度的样品溶液，吸附流速过大，树脂的泄露点就会提前，导致吸附量下降、吸附率降低。 但吸附流速过小，吸附时间就会增加，在实际应用时，应综合考虑来确定最佳吸附流速，一般控制在1-2BV/h. 对同一浓度的银杏叶黄酮溶液，用D140树脂进行吸附，吸附流速为 1、 2、 3BVh时，其吸附率分别为 56.14、 53.79和 51.97。 用NKA9树脂吸附茶多酚时，随着吸附流速的加快，树脂

23、的泄露点提前，吸附量下降 （表138）,表138 吸附流速对NKA9树脂泄露点和吸附量的影响,26 吸附泄露点和泄露曲线 每种大孔吸附树脂都有一定的吸附容量。当吸附量达到饱和时，树脂对组分的吸附减弱甚至消失，此时组分就会泄露，据此就能得到树脂的吸附泄露点，计算树脂的吸附量，为评价树脂吸附性能、预算树脂用量与可上柱样品量提供依据。吸附泄露点通常需要通过考察树脂的泄露曲线来确定。,3树脂解吸附（树脂洗脱） 31 洗脱溶剂 洗脱溶剂的选择应符合两种要求：一是洗脱溶剂应能使大孔网状吸附剂溶胀，这样可减弱组分与吸附剂之间的吸附力；一是洗脱溶剂对组分溶解性良好。因为解吸时不仅需要克服吸附力，而且当溶剂分子扩散到吸附中心后，应能使组分很快溶解。,对于非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强；对于中极性和极性树脂，则用极性较大的洗脱剂为宜。实际应用时，应根据大孔吸附树脂对组分吸附力的强弱选用相应的洗脱剂及其浓度。常见的洗脱剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中乙醇应用最多。乙醇溶液的解吸附能力随乙醇浓度增加而加强。,树脂解吸附前，通常先用水洗脱，以除去残留在树脂床中未被树脂吸附的杂质，然后以不同浓度的乙醇溶液洗脱，同时配合适当的理化反应或色谱方法（TLC或HPLC）监测洗脱的情况。为了达到满意的洗