CRISPRCas解读

1、CRISPR/Cas9系统及其应用，CRISPR-Cas系统简介CRISPR-Cas系统工作机制CRISPR-Cas9基因编辑系统构建载体构建，导入目的生物或细胞株，CRISPR-Cas9系统应用CRISPR/Cas系统是RNA介导的遗传性获得免疫系统，广泛存在于细菌和古细菌中。1.2CRISPR-Cas系统的研究历史1987年，日本研究小组在K12 Escherichia coli的碱性磷酸酶基因附近发现了一系列连续物，之后发现广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，以正式群集的规则间隔命名的短回文重复序列2005年CRISPR的间隔序列2007年，在巴林等地首次发现了细菌利用CRSP

2、R系统抵抗噬菌体入侵的可能性；2008年，Marraffini等细菌CRISPR系统阻止外源质粒的转移，首次实验验证了CRISPR系统的功能，2013年初，MIT研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人类293T细胞EMX1和PVALB基因、鼠标Nero2A细胞Th基因进行定点突变同年，Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的目标部位形成双链或单链切口，激活细胞的DNA恢复机制，有效地介导外源基因定点插入。1.3CRISPR-Cas系统的结构，CRISPR群集(主要为CRISPR-Cas系统)，其长度与离散迭代序列R(repeat)相似，前置序列L(leade

3、r)，1.4CRISPR-Cas系统的类型，CRISPR/Cas系统有3种类型，其中生产链球菌的Type系统在人类细胞、鼠标、斑马鱼中已成功完成基因组定点转化，目前已广泛用于真核细胞的基因组编辑。CRISPR/Cas系统包括3个主要基因部位：编码相关蛋白质部位(Cas9、Cas1、Cas2、Csn2)、包含重复片段的小RNA部位(CRISPR部位)和1个辅助小片段RNA(tracrRNA部位)，2CRISPR-CAS系统的机制，2.1适应：获得间隔序列外源DNA片段侵入后，CRISPR/Cas识别入侵的核酸，扫描外源DNA潜在PAM(NGG序列)，将与PAM相邻的序列用作候选protospac

4、er，然后将CRISPR基因座的5个，2.2表达：表达和加工crispr的crispr区域首先转录为前体RNA(pre-crRNA)，然后被Cas蛋白切成较小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1个间隔序列和部分重复序列，tracrRNA也转录，crRNA，2.3干扰：干扰入侵核酸，复合物在crRNA诱导下被Cas9蛋白的核酸域被外源DNA分子切割。首先，RNA/Cas9复合体沿外来入侵DNA扫描，PAM序列与crRNA互补配对，Cas9蛋白分别利用HNH和RuvC域切割DNA互补链和非互补链，形成DNA的双链。在蛋白质组学(PAM)、嗜热链球菌中，PAM序列的大部分是5-NGG，5-NAG

5、效率低下，但也用于定位目标DNA，从而扩大目标DNA在基因组编辑中的选择范围介导切割效率在NGGNGANAG人类基因组中每8 BP PAM出现在类型和类型CRISPR/Cas系统中自身基因组CRISPR序列的下游无PAM序列中，从而将自身基因组DNA序列和外源DNA序列区分开来，防止自身免疫。，crRNA，成熟的crRNA可分为5个把手，3个发卡结构和间隔序列，5个把手具有保守性，3个发夹是核酸内部酶识别部位，5个末端重复序列的杆菌性优于3个端重复序列，与PAMs一起保护自己的CRISPR序列不被误切。CrRNA末端还包括决定目标基因效率的“种子区”序列，该区只要发生一次突变，目标基因就很可能

6、无法正确识别，但种子区外发生少量突变，识别功能失败并不容易。在CRISPR/Cas9中，目标识别必须完全保留PAM(NGG)和PAM附近的11bp种子序列，在14bp(PAM种子序列)序列中发生任何碱基突变后，CRISPR/Cas9的切割效率基本下降到0。指导tracrrna (trans-actatingcrrna)、RNase和Cas9完成前驱crrna的成熟。TracrRNA是识别和切割目标所必需的，tracrRNA的5端和成熟的crRNA3端的部分序列(约13bp)可能对配对形成茎环结构，从而保持crRNA和目标对很重要。多域蛋白，Cas9，REC-rec识别区域中富含精氨酸的-螺旋，

7、由ca S9蛋白900-1600氨基酸组成，与RNA-DNA异种二聚体的三端812核苷酸结合，在HNH domain-crRNA互补链PAM元素上游3nt处切割HNH域中的H840A突变体可以导致HNH域中的停用RuvC域(在非互补链PAM组件上游的38nt上剪切)。位于RuvC域中的D10A突变体可以禁用RuvC域。(RuvC位于蛋白质的n端的3个子域：RuvC，位于HNH域两侧的ruvc) PAM结合区，3CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建，3.1sgRNA设计目前的大部分研究都将补充目标DNA的crRNA和tracrRNA作为单个指南RNA(sis inguide RNA)将sgR

8、NA设计为约100nt，包括位于5段20nt的DNA互补区域、crRNA、3段7080nt的tracrRNA。一般来说，具有二级发夹结构和一个三端尾部的sgRNA旨在不影响编辑效率，但是PAM组件附近的12碱基必须严格配对。Cr RNA/tracrrna/ca S9、sgRNA/ca S9，目前(2014.10)报告的CRISPR/Cas系统中使用的gRNA有两种结构，一种是M.Jinek另一个基本相同，但添加了3段更长的完整tracrRNA系列，关于这两个结构的优缺点，麻省理工大学张峰研究组发现，3段越长，gRNA表达越丰富，相应的目标效率也越高。为了确保充分的靶活动，建议gRNA的3段长度

9、不是67nt以下，而是85nt长度时最有效。设计导向顺序时要特别注意，第一碱基必须是g，如果选定导向顺序的第一碱基不是g，就要直接添加1个g，因为这个g对起始转录很重要。线上工具设计：MIT的cris pr design:http:/crispr . MIT . edu/德国癌症研究中心的e-crisp:www . e-crisp . org/e-crisp/design crispr添加NLS信号的位置还存在争议。根据L.CONG的研究，将NLS信号同时添加到Cas9蛋白的n端和c端是最有效的指令，Cas9蛋白放入核心。像P.Mali一样，在Cas9蛋白的c端添加NLS信号而创建的CRISP

10、R/Cas9基因编辑系统，在人类细胞中可以获得高达25%的敲孔效率，这意味着在c端添加NLS信号可以诱导Cas9蛋白进入细胞核。但是南京大学的研究人员发现，即使将SV40认可位信号全部添加到Cas9蛋白的n端，3个或n个，c端，Cas9蛋白也不能进入293T细胞的核，只有在n端添加认可位信号，在认可位信号和Cas9蛋白之间添加32个氨基酸残基连接器，才能将Cas9蛋白引导到核。这种不匹配的结果表明，每项研究中添加FLAG标签的位置的差异可能导致此差异，但在Cas9蛋白质减少的同时，可能会干扰NLS信号的识别。4载体构建，导入对象生物或细胞株，筛选，4.1载体构建，Cas9蛋白和gRNA的表达箱

11、分别构建在2个载体上或直接构建在同一1个载体上，可以方便Cas9蛋白和gRNA的共同表达。这两种策略各有优点。例如，适用于构建在同一载体上，有利于Cas9蛋白和gRNA共同表达的转染困难的细胞。在两个表达载体上开放，可以使gRNA候选人的目标效率和目标情况检测更加容易和快捷。构建gRNA的时候，基因序列连接到gRNA骨骼，或者直接合成有目标序列的GRNA，连接到表达载体就行了。4.2导入目的生物或细胞系在人工培养的哺乳动物细胞中，通过电穿孔、核转染、脂质体介导转染等，将没有自主复制的质粒DNA导入细胞，Cas9和sgNA可以即时表达。慢性病毒载体(lentiviralvectors)也用于构成

12、人或鼠标细胞中的Cas9和sgNA。可以直接注入斑马鱼、果蝇或老鼠的胚胎细胞的质粒越大，成功率越低，4.3筛选中包含Cas9、诱导NA和突变部位的目标DNA的同源重组修复模板可以一起转化为目的菌株。如果在Cas9中为基因组目标DNA序列生成了DNA双链断裂，则同源重组修复模板将保留，因为修订模板在互补区域或PAM部位标识中存在突变部位，因此不会被Cas9再次切割。同源重组失败的基因组因Cas9的切割分解而无法存活。使用此方法，基因组编辑后的筛选效率将大大提高，基因组上不会留下筛选标记。5CRISPR-Cas9系统的应用，这是一种可以在基因组级别改变DNA序列的基因操作技术。该技术的原理是，制造

13、人工恩赛拉剂，从预定的基因组位置阻断DNA，切割的DNA是在细胞内DNA修复系统修复的过程中进行突变，达到将基因组转化为指定部位的目的。基因组编辑包括基因敲除，引入特定突变和定点转基因，5.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术，例如基因敲除的实验过程，1。从目标基因序列中找到NGG序列，获得其附近20多个碱基序列，设计并合成SgRNA。2。将sgRNA和cas9基因连接到向量。3 .敏感性状态，质粒熄灯，测序验证4。细胞培养和细胞转染5 .挖空效果检测6。为稳定敲除创建细胞株，5.2CRISPR-Cas9介导的转录抑制和转录激活，抑制：在CRISPR/Cas9的系统中，Cas9的剪

14、切域突变失去了Cas9蛋白的切割活性，但结合能力不受影响。失去此切割活性的Cas9蛋白被命名为Deadas9。在细胞中同时表达Cas9和gRNA，gRNA可以与Cas9蛋白结合。Cas9结合在目标基因的读取框架中，可以防止RNA聚合酶的扩张。如果Cas9结合到目标基因的启动子区域，就可以阻止基因转录的开始。激活：将dCas蛋白与有转录激活的蛋白质功能区融合，构建有转录激活活性的CRISPR-on系统。CRISPR转录激活系统的目标序列位置对激活效率有重要影响。目标序列与启动子相距适当距离时，激活效率更高。启动子上游目标序列的原位激活效率相对降低。如果目标序列离启动子太近或在打开的读取帧内，则会

15、产生抑制效果。使用同一CRISPR-on系统的其他crRNA意味着对目标基因的激活和目标基因表达都受到抑制。真核细胞的转录激活因子可以通过结合Cas9和单纯疱疹病毒转录激活剂16获得。5.3单切口酶，Cas9可以通过高保真基本切除修复途径(baseexcisionrepair，BER)修复，由单个Cas9n(Cas9n是D10A突变的突变，仅切割直接补充sgRNA的DNA单链)切割，5.4可以使用多个导向RNA序列同时编辑基因组的多个部位。5.5结合CRISPR/Cas9技术和成像技术，利用dCas9的基因组定位功能直观地观察鼠标或人类基因组的各个组成部分动态变化基因组大小的功能筛选，特定染色体部位的标记等6CRISPR-Cas9系统的缺点，目标效果：CRISPR/Cas系统的目标部位离PAM地区很远的5个区域的识别特异性很低，即使几个碱基的匹配不正确，Cas9蛋白质也会切断其顺序，产生目标效果。V.Pattanayak等研究表明，CRISPR/Cas复合材料的浓度也与目标效应密切相关。如果CRISPR/Cas复合材料的浓度较高，即使PAM区域内部或PAM区域附近出现不一致，DNA切割也会进行，浓度较低时不会发生这种情况。限制：CRISPR/Cas9目标序列的标识和组合必须具有PAM。因此，该系统对基因组的目标识别部位被限制在平均8个碱基一个位置。问题CRI