实验十三石蜡切片法

1、第四模块生物显微制片技术,生物显微制片技术根据材料的性质和制作法的不同，生物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类：切片法：徒手切片法；石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法等。本模块主要介绍石蜡切片法、冰冻切片法。,石蜡切片法石蜡切片法是利用石蜡作为组织支撑物，对组织标本进行切片和染色观察的制片方法从取材开始，到制成切片标本为止，其间必须经过以下各主要步骤：一、取材二、固定三、洗涤四、脱水五、透明六、透入与包埋七、切片八、贴片九、染色十、封藏,实验十七石蜡切片法（一）取材、固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋一、实验目的1.理解取材、固定、洗涤、脱

2、水等各步骤的基本原理。2.了解取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的注意事项。3.掌握取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的操作方法。,1.取材：用于制片的动植物材料应选择新鲜的，用陈腐材料制片，往往不能反映材料的真正情况。2.固定：固定是借助化学药品的作用,使细胞组织的形态保存下来,不使其改变形态和变质。,二、实验原理,固定液的特点与作用,(1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。(5)使组织变硬，具有一定的硬度。(6)固定以后能起到保存的

3、作用,甲醛固定的原理,甲醛通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2-)，蛋白质不再发生改变，保存原位。醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露,1.取材的注意事项：材料应新鲜；动作要迅速；取病理材料时，应加对照。,固定的注意事项固定液以新配为好；固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定；材料固定完毕，保存于加盖的容器，贴上标签。,3.洗涤：洗涤是洗去渗入细胞内部的固定液。因材料中的固定液有的会妨碍染色；有的会发生沉淀或结晶，影响观察；有

4、的会继续作用，使材料变坏等。,3.洗涤的注意事项洗涤的时间要依固定剂的种类而定；固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗；含有铬酸、重铬酸钾等，必须用流水冲洗；长时间固定于福尔马林的应充分水洗。,3洗涤：材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水冲洗。流水冲洗时间一般需要12-24小时。,4.脱水：材料经洗涤后含有大量的水分，必须用脱水剂脱尽里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存。因为水分会使材料分解，而且透明剂与水是不相混合的，只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入。,4脱水：材料自低浓度至高浓度的酒精进行脱水。一般经50%、70%、85%、95%直

5、至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。,三、实验程序1取材：用单面刀片切取材料（厚度不超过3mm的立方体）、每人共切4小块。2固定：将已切好的组织放入10%的福尔马林溶液中固定12-24小时。固定剂一般为组织块体积的10-15倍。,4.脱水的注意事项脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏；在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，防止材料解体；在高浓度酒精中，每级停留的时间也不宜太长，防止材料变脆；脱水必须彻底，否则不易透明。,实验十八石蜡切片法（二）透明、透蜡、包埋一、实验目的1.理解透明、透蜡、包

6、埋各步骤的基本原理。2.了解透明、透蜡、包埋各步骤的注意事项。3.掌握透明、透蜡、包埋各步骤的操作方法。,二、实验原理1.透明是指利用透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，将脱水剂替换出来，使石蜡能顺利进入材料中。2.透蜡是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。,1.透明的注意事项(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中水分进入；(2)更换透明剂，动作要迅速；(3)材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。2.透蜡的注意事项(1)动物材料常用的石蜡熔点为52-56C；植物材料为54-60C。(2)透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；,3.包埋是把被石蜡浸透的材料连同

7、熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。,三、实验程序1透明：透明也是渐次由低浓度至高浓度。材料先在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸1530分钟，再转入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般1530分钟。2透蜡：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约4060分钟，再换纯石蜡一次约4060分钟。,3包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全

8、凝固（约30分钟）后即可取出备用。附：生物组织包埋机操作方法（演示）。,包埋机,3.包埋的注意事项(1)包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。(2)包埋用的镊子要先放在温箱中预热。,植物组织的透蜡过程必须缓慢进行，所须的时间比较长，约需1-2天。其法如下：将组织连同二甲苯一起倒入小蜡杯中；然后轻轻倒入溶解的石蜡。石蜡就在二甲苯的上层凝固起来。此时可将小蜡杯放在35-37C温箱内，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需1-2天；将蜡杯移入56-60C温箱中，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的石蜡，以后每隔1小时左右更换已熔的纯蜡一次，共换纯蜡2-3次即可进行包埋。,五、作业1.简述透明、透蜡、

9、包埋的基本原理及注意事项。2.分析实验结果。3.交已包埋好的蜡块。,实验流程：1.脱水：85%酒精（30分钟）95%酒精（30分钟）100%酒精（30分钟）。2.透明：1/2纯酒精+1/2二甲苯（20分钟）纯二甲苯中（1530分钟，至透明为止）。3.透蜡：材料透明后移入1/2二甲苯+1/2石蜡等量的混合液中(30分钟)，然后进入纯石蜡中约4060分钟，再换纯石蜡中约4060分钟(此部分操作在温箱中进行)。4.包埋：纯石蜡注入包埋用纸盒中，取蜡杯，用温镊子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固后即可取出备用。,实验十九石蜡切片法（三）切片、贴片一、实

10、验目的1.掌握切片、贴片的操作方法。2.了解切片、贴片过程中应注意事项。,二、实验原理切片是把包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。肝细胞（hepatocyte）体积较大，直径2030m，贴片是用粘贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色。常用的黏附剂有APES(3-Aminopropyl-Triethoxysilane3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)、多聚-L-赖氨酸(Poly-L-Lysine)、明胶、甘油蛋清等,三、实验步骤（一）切片切片前的准备工作（1）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长方形，组织四周留下23mm宽的石蜡。点燃酒精灯，然后用烤热的蜡铲放在台木和蜡块之间，利用蜡铲

11、的温度熔化两者的蜡，把蜡块粘附在台木上。（2）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。,2.切片机一般常用的为轮转式切片机，这种切片机的夹物部分是上下移动，前后推进的，而夹刀部分则固定不动。通过调整控制刀片厚度的微动装置就可以切出不同厚度的连续切片。,3切片的方法（1）将已固定修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。（2）将护刀盖推至打开位置。（3）摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口。（注意：在转动手轮时，应保证机头在红、绿线之间移动。）（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度。（已调好）,（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般4-10微米。（6）一

12、切调整好后就可以切片。此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度以每分钟40-50转为宜。（7）切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在蜡带盘上。（注意：靠刀面的一面较光滑朝下）。,（二）贴片1取一清洁的载玻片，滴一小滴（10uL）粘片剂于玻片中央，用手指涂抹均匀，晾干。2用刀片割一小段蜡带，放在水浴锅水面上，使其伸展。用载玻片斜插入水中，缓慢靠近蜡带，使其贴在玻片上，慢慢取出。3.把玻片标本置于展片台上（温度保持在40-45C），直到蜡片伸展摊平。5展片后把玻片标本编好记号，放在平盘上。,四、注意事项1.要严格按照操作程序进行切片。2.切片刀刀口锋利，应用时切

13、忌手指触及刀口,并且防止切片刀跌落桌上或地面，以免发生刀伤事故。3.切片机工作完毕，应将大手轮处于锁紧状态，此时机头在最上端，将护刀盖推至合并位置。4.及时清除废蜡，保持设备清洁。,选交8片玻片标本（6片肝组织切片，2片小肠组织切片）。,实验二十石蜡切片法（四）染色、封藏一、实验目的1.理解染色、封藏的基本原理。2.了解染色、封藏的过程中应注意的事项。3.掌握染色、封藏的操作方法。,二、实验原理1.染色：细胞和组织的不同结构之所以能被染成各种不同的颜色，是由于染料对它们所起的物理与化学综合作用的结果。(1)物理作用：如渗透作用、吸收作用、吸附作用等。(2)化学作用：疏水键、离子键、氢键等。,以

14、常用的苏木精-伊红对染法为例：细胞核内含有酸性物质，易与碱性染料苏木精中有染色作用的阳离子结合，细胞核被染上蓝色。细胞质含有碱性物质，易与酸性染料伊红中有染色作用的阴离子结合，细胞质被伊红染上粉红色。,2封藏：封藏是使已经透明的材料保存在适合折光率的封藏剂中，使材料能在显微镜下清晰的显示出来，并能长期保存。,三、实验程序1.染色的一般方法由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精，下降至水，经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明然后封藏。,苏木精伊红（简称H.E）对染法(1)二甲苯脱蜡10min。(2)二甲苯与纯酒精等量混液5min。(3)纯酒精，95%、85%、70%、50%酒精各3min。(4)蒸馏水1min。(5)埃利希氏苏木精染色液7min。(6)流水冲洗5min。0.51盐酸酒精（70酒精配制）分色20S。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止（7）流水冲洗5分钟，或者在1%稀氨水或碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化（20s），细胞核呈蓝色。,(7)1%伊红水溶液5min。(8)50%酒精数秒。(9)70%、80%、95%、纯酒精各3min。(10)纯酒精与二甲苯等量混合液5min。(11)二甲苯5min。(12)封藏:封藏于中性树胶中。,2.