基因工程克隆方案设计

1、基因工程克隆方案设计,基因工程实验设计,1、目的基因的序列分析2、载体的选择和分析3、克隆策略的设计4、引物的设计,目的基因的序列分析,1、分析ORF：找到需要克隆的核酸序列2、分析酶切位点：（1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆；（2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。,载体的选择和分析,1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点)3、表达载体，要注意表达框架配对。4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。,克隆策略的设计,1、平端克隆；2、粘端克隆（1）TA克隆（2）单酶切

2、不定向克隆（3）双酶切定向克隆,平端克隆,机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow酶补平，S1处理）产生平端；克隆效率较低，ligase要加大量；载体需脱磷；方向可正可反。,TA克隆,1、普通Taq酶扩增的PCR产物3末端会多加一个A;2、公司提供的T-vector的5末端有一个粘性的T;,用途:(1)PCR产物快速克隆：（2）基因测序（可正可反）；（3）利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点,单酶切不定向克隆,载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；基因插入可正可反，需要筛选。,双酶切定向克隆,类型：（1）粘-粘连接：最有效、最

3、快捷（2）粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平特点:(1)基因和载体都用两种酶切割；(2)连接效率高；(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定。,定向克隆的注意点：,（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；（2)载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）。,引物的设计,常规设计原则特殊用途设计技巧,引物常规设计原则,1.长度：7nt,一般nt左右;(仅binding,不含接头)2.G+C含量3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（20ntTm一般最佳PCR反应中结合温度

4、（anneaningtemperature）T=Tm-5,特殊用途引物设计技巧,1.5附加酶切位点(定向克隆):2.引入点突变3.有不确定序列4.PCR产物直接测序,5附加酶切位点(定向克隆),1、不同酶的保护碱基序列不同；NEBcatalog提供相关资料。,2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:Nde1EcoR1,引入点突变,1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.,2.突变位点要靠近5端.,3.要注意密码子的偏好性,简并性,有不确定序列（34种）,5ATGGGCICCAIAICTTCTACC3,说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对；2、可用于PCR产物直接测序。,有不确定序列（2种）,5ATGGGCACCATAGCTTCTA(A/C)C3,说明：1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：5ATG