分子克隆工具酶.ppt

1、分子克隆工具酶theenzymesinthemolecularlloning，chapter 7，chapter 7分子克隆工具酶，限制性核酸endozyme(特异性切割)甲基化酶(DNA分子甲基化)DNA聚合酶(合成dnna限制和修正限制酶的发现命名：主机名第一个字母(大写)种子名称前两个字母(小写)菌株编号罗马序列号，一个，限制和修正，the1 stsuchenzymefound，escherichiacoustic escalation，EcoRI，限定恩多核酸酶命名，名称中的名种名称序数来源菌株ecoriescherihiacoolirhindishindiihaemophilusin

2、fluenzaehindihtihtihthimorphilusinflus2、限制性酶识别序列的结构一般为回文对称结构EcoRI:GAATTCCTTAAG3，限制性酶切位置：大部分内部和外部，第二，限制性酶识别序列，Considerineardnamolecleule with 6 copied sofgattc 3333(thelargest fragment)、(thesmallestfragment)、digestionofnafragmentwitendonucleaseecori、Agivenmolerules2、“平整端”(Bluntend)在回文对称轴上同时切割两条DNA，产生

3、平整端。第三，限制性酶切的结束，(1)restrictionenzymesdiffer intherecognitionspecity : targetsitesaredifferent。(2)restrictionenzymesdiffer inthelengththeyrecognized、Andthusthefrequenciesdiffer、differencesofres、(3)retrospect(4)restrictionenzymesdiffer inthecravageactivity、differencesofres、sticky ends(粘性末端)、bluntends(

4、平面末端)、differencesofres如果识别序列是不对称序列，则被切割的DNA产品的末端会有所不同，例如识别切割站点CCTCAGCGGAGTCG部分限制性酶识别简单，序列和识别序列中的一些不对称BbvC。对于Acc，识别相同的酶，顺序为GTAT/CGACCATA/GCTG，3，不对称挤出端(1)。Hind和Hinc标识切割部位为GTYRAC(Y为c或t，r为a或g)的HPA和Hap标识切割场所CCGGMob和Sau3A标识切割部位为GATC，4，isoschizomer:标识相同序列的限制酶称为同一分割酶，但切割部位可以不同。(2)相同顺序的isozyme Kpn和Acc65识别的序列

5、相同，但每个Kpn:GGT ACC 65:GGT ACC，4，isoschizomer，(3)“相同操作多位”抑制酶包含不同限制酶的功能EcoR识别和切割部位GAATTCApo识别和切割部位RAATTY后者识别前者的序列。4，isoschizomer)，(4)限制酶识别的其他序列交叉。如果PUC系列质粒的多个复制站点具有Sal站点(由GTCGAC标识)，则也可能被Acc站点(由GTMKAC标识)和Hinc站点(由GTYRAC标识)截断。，4，isoschizomer，5，isocaudarner和其他限制性酶切DNA的末端是相同的，对称的。也就是说，可以生成相同的粘性末端。bam hi : g

6、gatccbgi : agatct 6，homingendonuclease包含用于子编码的内部酶。1，限制酶切割DNA时识别序列两端非识别序列长度的要求。2，酶单位：在适当的缓冲液和温度下，在20l反应体系中反应1h，完全消化需要1gDNA的酶量。3.设计PCR引物时，如果想在末端引入酶部位，就必须考虑添加满足酶要求的几种碱。第四，DNA末端长度对限制性酶切的影响，在相同基质的部分部位表现出偏好性切减，对不同位置的相同识别序列表现出不同的切减效率。1，酶对酶的耐受性不同的酶，2，切割相同量的其他DNA所需的酶量不同。5，站点首选，缓冲液：pH，Mg2，DTT，BSA反应温度：大部分37反应时

7、间：1-2h酶切终止方法：EDTA，加热，酚萃取去除蛋白，6、酶反应条件，在非常非标准的条件下，限制性酶可以切割与识别序列相似的序列。1.引起恒星活动的因素：甘油浓度太高，酶过多，离子强度低，pH过高等。2、抑制方法：降低甘油浓度、减少酶用量、提高离子强度、降低pH、确保无反应系统有机溶剂等。7，星形活动，部分切割双链DNA的酶也可以消化单链，但切割效率不同或下降。有些限制性内切酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即切割酶，并在开头加上n。8，单链DNA的切割，1，结果5挤出端平整后，可重新连接，形成新的酶切部位。2.东尾末端的连接：不同的东尾酶切掉DNA生成的末端，将其连接在一起时，

8、原始酶部位消失，可能会产生新的酶部位。3、平端连接是新的酶切位点pvuii (CAG ctg)生态RV (GATA TC) mboi : GATC，9，引入酶切位点，1，外部因素(可预测和控制)反应条件，气质纯度，酶量一般哺乳动物DNA不会被腺嘌呤N6甲基化，因此不受影响。在这个敏感部位需要完全切割DNA的时候，可以使用dam型E.coli放大和提取DNA。第一，甲基化酶的种类(甲酰基酶)，2，Dcm甲基化酶。识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个细胞色素c的C5位置引入甲基。受Dcm甲基化影响的酶是EcoRII(CCWGG)，但其同分解剂不受影响，因为触点不同。3、AAC(N)6GTGC和

9、EcoKI (n) 6 gtt序列中识别a N6位置的识别部位较少的回声键甲基化酶。4、源于原核蜗牛的SssI甲基化酶可以在C5位置甲基化CG序列的c。1，甲基化酶种类(methylase)，2，依赖甲基化限制系统，1，E.coli:McrA，McrBC，Mrr，识别顺序不同，但仅识别甲基化序列，CG甲基化酶(M . SssI)McrA:限制HpaII甲基化变形的部位。McrBC:限制两个半部分(G/A)m5C。Mrr: m6A限制。第三，甲基化对限制酶的影响，转化酶部位主要使酶部位甲基化，而不进行限制核酸内部酶的切割。2.生产新的酶，某些酶是依赖甲基化的限制酶，因此甲基化后产生新的酶。，第三

10、节DNA聚合酶，DNApolymerase的主要功能：原核生物3种：DNA聚合酶I，II和III，1，活性：大肠杆菌DNA聚合酶I是单链多肽，相对交换反应：如果只有一个dNTP存在，35外节体核酸酶活性从35端开始分解DNA，然后在该位置产生一系列连续的合成和外半反应，直到显示出互补dNTP的碱基为止。I，大肠杆菌聚合酶I，(1)大肠杆菌DNA聚合酶I的53外切割核酸酶活性，可以用切割转换方法显示DNA，并用作混合探针。方法：在Mg2存在下，用DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口，在切口中利用DNA聚合酶I的53外切核酸酶活性，沿53进行切口转换，结果产生的切口可由DNA聚合酶I用作催

11、化合成DNA的引物。合成过程中显示的dNTP继续添加到可用作混合探针的DNA链中。2，大肠杆菌DNA聚合酶I的用途，(2)在cDNA克隆中用于第二链合成聚合酶活性。被Klenow酶或逆转录酶取代。(3)用3个尖头的DNA做结尾，借此交换反应。(。转化为T4或T7DNA聚合酶。2，大肠杆菌DNA聚合酶I的用途，2，大肠杆菌被蛋白酶分解后，53外体酶活性肽段从酶中去除，是大片段肽段，聚合活性和35外体酶活性不受影响，相对分子质量为76103。可以用基因工程生产。(1)展平DNA的3凹端。(利用DNA聚合酶活性，加入足够的dNTP，例如挂标签或做标记；(2)把DNA的3凸起末端展平。(3-5外切核酸

12、酶活性，3凸端去除，添加足够的dNTP。T4和T7DNA聚合酶可替代(3)替代反应对DNA的端标记(4)随机引物标记(聚合酶活性)(5)测序、cDNA合成第二链等其他用途。KlenowDNA聚合酶作用，3，T4噬菌体DNA聚合酶，T4phageDNApolymerase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，其相对分子质量为114103，活性类似于KlenowDNA聚合酶，但35侧核糖核酸活性为2003T7噬菌体感染的大肠杆菌产生的4，T7噬菌体DNA聚合酶是由两种紧密结合的蛋白质组成的复合物。一种是噬菌体基因5编码的蛋白质，另一种是宿主细胞的硫氧还蛋白。活性类似于T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow

13、DNA聚合酶，但可替代T4噬菌体DNA聚合酶功能，并可用于模板引物扩展的KlenowDNA聚合酶活性是1000倍。5，用于耐热DNA聚合酶，高温下活性DNA聚合酶，高温下强细菌，主要用于PCR反应。TaqDNA聚合酶、bent DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和TthDNA聚合酶。VI，逆转录酶，依赖RNA的DNA聚合酶，53合成DNA活性，无35外体酶活性。来自鸟类骨髓细胞瘤病毒(AMV)和Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒，也称为M-MuLV)。53聚合酶活性和强RNaseH活性(在对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有影响的DNA:RNA杂交链中，RNA链中磷酸

14、二酯键的特定水解)。cDNA合成开始：引物和mRNA模板杂交可以成为RNaseH的基质，模板分解与CDNA的合成竞争。反应终止：RNaseH在生长中的DNA3终端切模板，抑制cDNA的合成。AMV逆转录酶，RNaseH缺陷型莫洛尼卡白血病病毒(M-MuLV)逆转录酶是RNA介导的DNA聚合酶。这种酶可以在合成cDNA(cDNA时)或单链DNA作为模板，从引物开始，合成互补的DNA链。RNaseH活性的缺失提高了这种酶合成长链cDNAs的能力。M-MuLV逆转录酶，逆转录酶活性，53DNA聚合酶活性(需要Mg2)，即以RNA或DNA为模板，用具有3-OH的RNA或DNA引物合成DNA。53和35外源核酸酶活性产生长420碱的核苷酸，包含5磷酸和3-OH。如果没有35外切核酸酶校正效果，在高浓度dNTP等条件下，每500个碱基就可能有一个错误的混合。源于小牛胸腺的7，末端转移酶是存在于前淋巴细胞和分化早期淋巴细胞的DN