第三章 离子交换层析

1、第三章离子交换层析,第一节基本原理第二节离子交换剂的分类及性质第三节离子交换剂层析操作第四节应用,第一节基本原理,概念：利用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在离子交换剂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从离子交换剂上洗脱下来，达到分离的目的。,1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前，离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯

2、化。,原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团、反离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。反离子是结合于电荷基团上的平衡离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。,纤维素-O-CH2-COO-Na+,载体,电荷基团,反离子,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，可重复使用

3、,起始缓冲液中的反离子,样品液中的离子,洗脱液中的离子,对于呈两性的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，取决于物理化学性质和离子状态。,pHpI，带负电荷，相同pH条件下，pI越小越容易吸附。,第二节离子交换剂的分类及性质,实用的离子交换剂应满足下列要求,有高度的不溶性有疏松的多孔结构和巨大的比表面积有较多的交换基团有稳定的物理化学性质,一、分类根据载体的组成和性质分为：,（一）疏水性离子交换剂（二）亲水性离子交换剂,（一）疏水性离子交换剂载体是一种人工合成的、与水结合力小的树脂物质。苯乙烯和二乙烯苯的聚合物，海绵状结构。再共价结合引入电荷基团,树脂的网络骨架,根据孔径大小分

4、为：20-50目、50-100目、100-200目、200-400目。目数越大分辨率越高、交换容量越高。,常用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸、氨基酸等小分子物质。不易变性的蛋白质除去表面活性剂、尿素、两性电解质,1、阳离子交换剂,阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。阳离子交换剂中的电荷基团是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基团。强酸性：R-SO3HNa+R-SO3-Na+H+弱酸性：R-COOHNa+R-COONaH+,2、阴离子交换剂,阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电，可

5、以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应。阴离子交换剂中的可解离基团是伯胺（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺-N(CH3)2和季胺-N(CH3)3等碱性基团。强碱性：R-N(CH3)3OHClR-N(CH3)3ClOH弱碱性：R-NHCH3OHClR-N(CH3)2ClOH,（二）亲水性离子交换剂,亲水性离子交换剂的载体是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。常用的有纤维素(Cellulose)、交联纤维素(Sephacel)、交联葡聚糖(Sephadex)、交联琼脂糖(Sepharose)。引入电荷基团,1、纤维素离子交换剂,2、交联葡聚糖离子交换剂,由数个葡萄糖分子聚合而

6、成在葡聚糖的羟基上引入电荷基团,以sephadexG-25和G-50为载体，引入电荷基团制成的。,A：anion（阴离子）C：cation（阳离子）sephadexG-25和G-50：G后面的阿拉伯数字为凝胶得水值的10倍。如：G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克,3、琼脂糖离子交换剂,琼脂糖离子交换剂一般以SepharoseCL6B为载体引入电荷基团,以SepharoseCL6B为载体，引入电荷基团制成的。,二、性质,（一）颜色与形状树脂类离子交换剂颜色很多，褐色、黄色、乳白色等；亲水性的离子交换剂基本都是白色的。（二）交联度：交联剂在载体中所占的百分数。树脂交联剂为二乙烯苯，交联葡聚糖和纤

7、维素的交联剂为3-氯代-1，2-环氧丙烷，琼脂糖交联剂2，3-二溴丙醇,（三）吸水量（膨胀度）载体随交联度增加而降低电荷基团强碱型离子交换剂比弱碱型的膨胀度大溶液离子强度和pH交联度小的在低离子强度溶液的膨胀度比高离子强度溶液大,与交联度关系,与电荷强弱关系,与pH关系,（四）交换容量,指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。1、影响因素筛孔离子强度pH,交换容量与pH关系,2、交换容量测定离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的摩尔数（mol/mg或mol/ml）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl处理，使其平衡离子为H+。再用水洗至中性

8、，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H+，再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl，就可以计算出离子交换剂的交换容量。,（五）稳定性离子交换剂都具有很好的理化稳定性。树脂类离子交换剂在较高的酸碱溶液中短时间处理后，性质无改变；亲水性离子交换剂在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂等溶液中是稳定的。,（六）比重离子交换剂经过溶胀后比重是恒定的。在装柱之前要充分溶胀，防止发生上浮现象。,（七）流速影响柱压影响分辨率,流速与柱压关系,流速与分辨率关系,第三节离子交换剂层析操作,1、离子交换剂的选择,选择离子交换剂的原则,首先是阴阳离子交换剂的选择其次是强弱离子交换剂的选择然后是不同离子型交换剂的选择最后

9、是不同载体离子交换剂的选择,阴阳离子交换剂的选择取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷。如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂；如果被分离的物质为两性离子，则根据其稳定的pH范围所带的电荷来选择。例如：某蛋白质的pI为5，若在pH5-8稳定，则选择阴离子交换剂；若在pH5以下稳定，则选择阳离子交换剂。,一般来说，强性离子交换剂适用的pH范围广，常用来制备无离子水和一些在极端pH溶液中易解离且较稳定的物质。弱性离子交换剂pH范围窄，在pH中性的溶液中交换容量高，常用来分离生命大分子物质，确保不易失活。一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。,强弱离子交

10、换剂的选择,离子交换剂处于电中性时，常带有反离子，如H+、Na+、NH4+、OH-、Cl-等。如何选择取决于离子交换剂与反离子的结合力。为了提高交换容量，应选择结合力较小的反离子。强阳性和强阴性离子交换剂应选择H型和OH型；弱阳性和弱阴性离子交换剂应选择Na型和Cl型。,不同离子型交换剂的选择,不同载体离子交换剂的选择,颗粒大小,离子交换剂使用量的计算,要根据离子交换剂全部交换容量和待分离物质的总量来计算。当溶液中含有各种杂质时，必须考虑交换容量留有充分余地，实际交换容量只能按理论交换容量的25%-50%来计算，甚至更低。,举例：,用717树脂分离200L含有2.2mol量的肌苷溶液，树脂的理

11、论交换量为3.5mmol量/g，实际参与交换的树脂仅为理论交换量的7%，求需要717树脂的量。2.21000(3.57%)8900g,2、离子交换剂的处理,酸碱浸泡进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。每次酸碱处理后用蒸馏水洗涤至中性。,膨化将干粉在水中充分溶胀，使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的基团充分暴露出来。,水悬浮去除杂质和细小颗粒,抽气排除气泡,3、缓冲液的选择,保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；注意缓冲液中不能有与离子交

12、换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。,离子强度和pH,4、层析柱的选择,离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间。,亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大增加柱长为宜。层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。,采用离子强度较大的梯度洗脱选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交

13、换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为1520cm。,5、上样,样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。不溶物应以离心法除去。上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1-5。,6、洗脱,改变洗脱液的pH或改变离子强度使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，或降低pH值。使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，或升高pH值,洗脱方法阶段洗脱和梯度洗脱阶梯式梯度洗脱：分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。缺点：由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。线性梯度

14、洗脱：在同一个分析周期中，按一定程度连续不断地改变洗脱液的浓度配比进行洗脱。,离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的；制备梯度溶液的装置是出两个彼此相通的圆筒容器和一个搅拌器组成。,实践中采用何种形式梯度洗脱液较为理想，这完全取决于特定的应用要求，并无规律可循。一般最好从线性梯度开始，然后按照摸索试验进行。在阶梯式梯度溶液中所用的适宜浓度，应在线形梯度溶液的基础上慎重地选定。,在一定时间内，不同形式的梯度液流经层析柱某点累积体积时的浓度C，可用公式计算：,C=CB-（CB-CA）(1-)CB：B瓶浓度CA：A瓶浓度V2：流经层析柱体积V1：洗脱液

15、的总体积,V1,V2,举例：,离子交换层析中，以0.1-0.5mol/L的NaCl梯度的缓冲液洗脱（总体积200ml，梯度瓶直径相同），通过层析柱75ml时，NaCl浓度是多少？0.5-(0.5-0.1)(1-)=0.25mol/L,75,200,7、洗脱速度,洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率好如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。,8、洗脱液的监测收集及组分鉴定,监测用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定聚丙烯酰胺凝胶

16、电泳、测定活性等,9、离子交换剂的清洗、再生和保存,可溶于碱的污染物0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤，可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤，可以除去脂类和其他的疏水性物质。,金属污染物EDTA饱和的10mmol/LHCL（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6mol/L的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。,再生对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡保存处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮钠，

17、4C下保存。,第四节应用,鸡卵类粘蛋白的纯化,处理离交剂量取DEAE-纤维素粉（DE-32）50mL，用100mL0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡20min。用G-3漏斗抽滤后再用蒸馏水洗至pH8.0左右，抽干。然后移至250mL烧杯内，用100mL0.5mol/LHCl溶液浸泡20min，再转移到G-3漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，抽干。最后转移到烧杯内，用60mL0.02mol/L,pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，脱气后装柱（15200mm）。,2)装柱（小心操作）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。,4)洗脱改用含0.3mol/LNaCl的0.02mol/LpH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰并量体积。,3)上样吸附脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。控制流速20d/min，待样品全部入床后，用0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂