生理学实验报告-蛙心灌流

1、实验名称：离体蛙心灌注课程名称：生理学实验讲师：龙天成、陈测试人：叶永峰08344031学院：海洋学院实验时间：2009年12月9日一.目的要求1.学习离体蛙心灌注方法。2.了解心肌的生理特征。3.观察钠、钾、钙、肾上腺素和乙酰胆碱对离体心脏活动的影响。第二，“原则”将离体蛙心(去神经蛙心)保存在合适的环境中，仍可保持一定时间的节律性收缩。心脏正常的节律活动需要合适的物理和化学环境，孤立的心脏也是如此。离体心脏不受身体神经支配和体液因素的直接影响，其对心脏活动的影响可以通过改变灌注液的某些成分来观察。心肌细胞的自主性、兴奋性、传导性和收缩性都与钠、钾和钙离子有关。当血液中的钾浓度过高(高于7.

2、9毫摩尔/升)时，心脏的兴奋性、自律性、传导性和收缩性都降低，表现为收缩性降低、心动过缓和传导阻滞。在严重的情况下，心脏可能在舒张期停止。当血钙浓度增加时，心脏收缩性增加。如果血钙浓度过高，心室将在收缩期停止。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。血液中钠离子浓度的微小变化对心肌没有明显影响，只有发生明显变化时，心肌的生理特性才会受到影响。肾上腺素能增加心率、传导和心肌收缩力，而乙酰胆碱的作用与肾上腺素相反。3.实验仪器青蛙、常用手术器械、青蛙盘(或蜡盘)、青蛙心脏钳、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹钳、双针形玫瑰刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥和任氏溶液。蛙心套管(斯科特

3、套管或八木套管)，套管夹，0.65%氯化钠，5%氯化钠，2%氯化钙，1% KCl，1: 5 000肾上腺素，1: 10 000乙酰肌氨酸和300单位/毫升肝素。4.方法和步骤1、蛙心插管法(1)一只青蛙，它的背部被置于蜡盘中，两个果肉都被破坏，根据前面的方法暴露它的心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下穿一条线，在动脉锥处结扎(当动物很小时，结扎位置是可靠的)。然后在左右主动脉下穿一条线，打一个活结以备后用。用左手提起主动脉上的结扎线，用右手的眼用剪刀沿向心方向在动脉上壁切一个斜切口。选择合适大小的蛙心插管，然后将含有少量任氏溶液(高2 3厘米)(含一滴肝素溶液)的蛙心插管插入

4、山口，并插入动脉锥(见右图)。当套管的尖端到达动脉圆锥的底部时，套管应该稍微缩回，以便尖端可以被推向动脉圆锥的下背部和顶点，并通过主动脉瓣插入心室腔(当心室收缩时插入，但不要太深，以免心室壁阻塞套管的下开口)。此时，可以看到套管中的血液将人冲入套管中，并且液位随着心脏的跳动而下降，这表明手术是成功的(否则，需要将其返回并重新插入)。用滴管吸取插管中的血液，并更换新鲜的任氏溶液。待套管稳定后，轻轻提起备用线，用双结扎法将左、右主动脉与插入的套管绑在一起(无泄漏)，然后将连接线固定在套管的小玻璃挂钩上，然后切断结扎线上方的血管。轻轻提起插管和心脏，观察静脉窦的位置，切除静脉窦下方的相关组织，仅保持

5、静脉窦与心脏的连接，从而将心脏与身体隔离(切勿损坏静脉窦)。用任氏液反复冲洗心腔内残留的血液，使插管内的灌注液中没有残留的血液。保持套管内液位一致(1.52厘米)，即可进行实验。(2)将插入有离体心脏的插管固定在支架上，用蛙心夹住一点点心尖肌(不要夹得太多，以免夹住心室造成渗漏)。然后，将蛙心夹上的绑线缠绕在滑轮上，并将其与张力传感器相连(如右图所示)。注意：不要让灌注液滴在传感器上。将显示器上心脏收缩曲线的幅度调整为中等。2.实验观察(1)记录正常心跳曲线(2)用0.65%氯化钠溶液灌注，并做剂量标记，观察心跳变化。当曲线插管器有明显变化时，立即吸取插管中的灌注液，标记冲洗，用新鲜的任氏液冲

6、洗2-3次，直至心跳恢复正常。注：换液时不要触摸套管，以免影响追踪曲线的基线，保持灌注水平一致(下同)。观察到，氯化钠溶液能抑制心跳。(3)向套管内加入2 6滴5%氯化钠溶液(套管越薄，加量越少)，做好给药标记，观察心跳曲线频率和振幅的变化。当曲线发生明显变化时，应立即吸取套管内的灌注液，并做好冲洗标记。用新鲜任氏液快速冲洗2 3次，直至心跳恢复正常。(4)用同样的方法在插管中加入1 3滴2% caci:溶液，观察并记录心率曲线的变化。当有明显变化时，立即更换任氏液，等待心跳恢复正常(若恢复缓慢，可冲洗数次)。(5)在插管中加入1-2滴1% KCl溶液，记录心跳曲线的变化。当心跳曲线改变时，以

7、同样的方式改变灌注液，并等待心跳恢复正常。(6)用同样的方法记录在插管中加入110000的1 2滴肾上腺素溶液后的心跳曲线变化。(7)用同样的方法记录1-2滴乙酰胆碱溶液(1: 10 000)后的心跳曲线变化。3.实验结果和分析记录的心跳曲线附在实验报告上，并计算给药前后曲线的频率、振幅和基线变化。测量结果填写在表格中。5.实验结果1.正常攻击图2.滴加0.65%氯化钠溶液示意图分析：滴加0.65%氯化钠溶液后，心脏搏动减弱，这是由于用0.65%氯化钠溶液灌注蛙心时，灌注液中缺乏Ca2所致。3.滴入5%氯化钠溶液分析：细胞外液钠浓度梯度的变化一般对心肌活动无明显影响。因此，与图2中0.65%氯

8、化钠溶液的下降相比，上图中的心率变化不是很大，同一溶液在两种不同浓度下的作用机理是相同的，所以这里没有太多相同的分析。但是，如果在实验中滴加溶液的顺序不同，如果先滴加5%的氯化钠，然后再滴加0.65%的氯化钠溶液，心跳的变化就不会像图3中那样明显，收缩力的变化也很小。4.滴入2 L溶液分析：胞外Ca2+竞争性地抑制细胞膜上的钠内流，这被称为膜屏障。当Ca2 0增加时，钠内流受到抑制，细胞在0期的去极化速度和幅度降低，从而降低兴奋性和传导性。随着Ca2 0的增加，Ca2的内流增加，慢反应细胞的0期去极化和电导率增加，而快反应细胞的平台期、有效不应期和复极期缩短。Ca2+的流入增加了心肌的收缩性。

9、当Ca2 0降低时，变化与钙高时相反。因此，加入氯化钙后，心率和振幅下降，基线上升。5.丢弃1%KCl溶液分析：下降1%后，发现曲线的频率和振幅逐渐下降，最终停在基线，即心脏停在舒张状态。因为当细胞内钾浓度增加时，钾与钙具有竞争性拮抗作用，钾抑制细胞膜对钙的转运，从而减少进入细胞的钙，减弱心肌兴奋和收缩的耦合过程，降低心肌的收缩性。心跳曲线振幅减小。6.滴1: 10000肾上腺素溶液分析：注射肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，记录的心跳曲线振幅明显增加。其作用机制是肾上腺素能与心肌细胞膜上的B受体结合，改善心肌细胞和肌浆网膜的Ca2通透性，导致肌浆组织Ca2浓度升高，从而增强心肌收缩。此

10、外，肾上腺素可降低肌钙蛋白与Ca2之间的亲和力，促进肌钙蛋白对Ca2的释放速率，增加肌浆网对Ca2的摄取速率，刺激Na和Ca2的交换，加速细胞复极过程中Ca2的排出，从而加速心肌舒张，明显增强整个舒张过程。7.滴1: 10000乙酰胆碱溶液分析：从上图可以看出，蛙心收缩减弱，心率减慢，最后蛙心停止放松。其机制是乙酰胆碱与心肌细胞膜的M受体结合，一方面改善心肌细胞膜钾通道的通透性，促进钾外流，这将导致：1)强窦细胞复极时，钾外流增加，最大复极电位绝对值增加；Ik衰减过程减弱，自动去极化速度减慢。这两个因素导致窦自主性和心率下降。2)复极过程中，钾外流增加，动作电位2期和3期缩短，进入细胞的钙减少

11、，心肌收缩减弱。另一方面，乙酰胆碱可直接抑制Ca2通道，减少Ca2流入，进而减弱心肌收缩。表1:测量结果的比较表1改变灌注成分对离体蛙心活动的影响实验项目心率/(次/分钟)振幅/g基线变化(向上或向下)其他的0.65%对比521.47给药511.47心脏收缩性降低恢复521.85%对比521.8给药512.82上移心脏收缩性降低恢复622.62%对比491.65给药492.16上移收缩力没有明显增加，但基线明显上移恢复501.94上移1%对比522.27给药591.91稍微向上移动心脏收缩性降低恢复582.051: 10000肾上腺素对比511.83给药512.64心脏收缩力增加恢复552.6

12、71: 10000乙酰胆碱对比461.06给药01.06心脏收缩性降低恢复520.77上移6.注意事项1.准备蛙心标本时，不要损伤静脉窦。2.上述实验项目一旦出现，应立即用正常人的溶液冲洗，以免造成心肌损伤，下次实验只能在心跳恢复正常后进行。3.综述心肌生物电的机制和各种离子对心脏活动的影响。4.尽量选择强壮的雄性蟾蜍，注意保护心脏，避免手术中受伤。5.实验过程中及时用任氏溶液冲洗心脏，待曲线稳定后再进行下一步。6.任的溶液每次更换时，灌注液的液位必须保持恒定，以免因灌注流量的变化而影响结果。7.严格控制每种药物的剂量，先加一滴，再加一滴，效果不明显。8.滴药和更换正常人的溶液应及时做好标记，

13、以便观察和分析。9.任氏液滴瓶中的吸管和蛙心套中的吸管应分开使用，不应混淆，以免影响实验结果。思考问题1.离体蛙心准备好后，有时博物馆里的液面不会明显上下移动。原因是什么？如何处理它？答：离体蛙心准备好后，蛙心插管中的液体应随着蛙心室的收缩和舒张而上下移动。其实质是：当心室收缩时，心室容积减小，室内压力增加，心室中的液体被压入套管，管内液面上升；当心室舒张时，心室容积增加，心室内压降低，插管中的液体被吸入心室，导管中的液位降低。但是，有时蛙心插管内液位波动不明显，主要原因是：(1)套管尖端出现血凝块。插管中的液体不能溢出套管进入心室腔过深，以致套管尖端抵住心室壁。解决方法是轻轻提起插管，使插管

14、开口正好在心室腔内，开口面向液体射流的轴向流动方向。蛙心因长期心肌失血而失去活力。解决方法是往插管里滴入一点肾上腺素，或者施加外力使其加速并增强其活性。房室传导阻滞。在插管手术中，由于操作不当，对心脏的损伤太大，最终导致房室传导阻滞。因为这种损害是不可逆转的，我们必须改变青蛙的心脏，重新做实验。2.在实验过程中，为什么蛙心插管中的液位必须保持恒定？如果液位过高或过低会发生什么？答：在实验过程中，蛙心插管中的液面发生变化，心脏收缩曲线也随之变化。心肌缩短的幅度和速度受前负荷和后负荷的影响。插管液体水平产生的压力相当于心室舒张末期心肌的预负荷。当心室开始收缩时，这种液体产生的压力成为心肌收缩的后负

15、荷。因此，身高的变化，以及前后负荷的变化，都会改变心肌收缩的幅度和频率。当液位过高时。收缩曲线的幅度会减小。由于过高的液体水平，心室前负荷将超过最佳前负荷，这将导致粗肌丝和细肌丝之间的过度分离，导致收缩电位降低，而心肌收缩没有增加或减少。同样，过高的后负荷会大大降低心肌收缩的幅度和速度。当液面过低时，心室收缩的幅度也会降低。因为预载太小，粗肌丝和细肌丝彼此靠得太近，导致收缩电位降低。事实上，前负荷降低引起的心室收缩效率降低比前负荷增加引起的心室收缩效率降低更明显。同样，后负荷的相应减少也会导致心室收缩的减少。因此，在实验中保持最佳液位。这是获得较好实验结果的前提。3.各种离子成分改变青蛙心脏收

16、缩的原理是什么？答：由于心肌细胞的生物电活动和收缩过程与离子密切相关，细胞外液中离子浓度的增加或减少都会影响心肌的电生理特性和收缩能力。(1)钾离子钾的影响与静息电位的形成有关。细胞外液钾浓度k0对心肌生理特性的影响是复杂的。高钾：当K 0稍有或适度增加时，膜内外钾浓度差减小，静息电位绝对值减小，与阈电位的距离缩短，兴奋性增加。当k 0显著增加时，静息电位绝对值下降太多(膜内达-55mV)，钠通道失活，兴奋性降低甚至消失。此外，0相去极化的速度和幅度降低，电导率降低，这导致慢化甚至阻断激发传导。此外，增加K 0还可以提高膜对钾的通透性，加速钾的外流，缩短动作电位的平稳期，从而缩短不应期。此外，由于平台期缩短，钙内流减少，细胞外钾和钙对细胞膜的竞争性抑制导致心肌收缩功能减弱。(2)钙离子胞外Ca2+的影响竞争性地抑制了细胞膜上的钠内流，即所谓的膜屏障。当Ca2 0增加时，钠内流受到抑制，细胞在0期的去极化速度和幅度降低，从而降低兴奋性和传导性。随着Ca2 0的增加，Ca2的内流增加，慢