组培实验室的设计.ppt

1、1,第一章植物组织培养实验室构建,2,第一节：商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备,主要内容： 实验室的设计 仪器设备和器皿用具,3,在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,一、实验室设计

2、,4,组培实验室设计原则：,保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,5,组培实验室组成：,标准组织培养室包括: 洗涤室（区） 制备室（区） 灭菌室（区） 储放室（区） 操作室（区） 培养室（区） 观察室（区） 药品室（区）, 可以根据自己的实际条件进行合并,6,准备室：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备： 药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器. 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。,7,卧式灭菌锅,8,无菌操作室（接种室）：

3、 主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。 接种室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。 接种室应设有缓冲问，面积1m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯

4、，用以照射灭菌。,9,超静工作台,10,酸度计,11,培养室： 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。培养材料放在由金属制成培养架上培养。培养架一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架高17m左右。其长度根据日光灯长度而设计， 如采用40W日光灯，则长I3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027左右，具备产热装置，并

5、安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。,12,细胞学实验室 该室用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。小型仪器设备有：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等

6、。,13,显微镜,显微镜,14,玻璃器皿及用具,玻璃器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等； 显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。 微孔过滤器（细胞过滤器） ：激素用于灭菌。 一般用石棉滤膜,15,第二节：培养基及其配制,主要内容： 培养基的成分 培养基的种类、配方及其特点 培养基的配制 1、培养基母液的配制 2、培养基的配制,16,一、培养基的成分,大量元素 微量元素 氨基酸和有机附加物 植物激素（植物生长调节剂） 维生素类 凝固剂,17,大量元素（以Ms培养基为例）,18,微量元素（以MS培养基为例）,19,氨基酸和有机附加物（以MS培养基为例）,20,植物激素（植物生长调节剂）

7、,1、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。 2、细胞分裂素类：KT，6-BA，ZT等。 3、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等 4、脱落酸：ABA 5、乙烯 6、PH值：5.6-5.8,21,培养基的种类、配方及其特点,按性质分 基本培养基 ：MS、MT（Murashige and Tucher）White 完全培养基 基本培养基 其它成分（激素、有机物质等）,22,按状态分 固体培养基；液体培养基。 按作用分：诱导培养基；增值培养基、生根培养基。 按培养过程分：初代培养基、继代培养基。,23,培养基配方及特点,参见课本p1718,24,培养基

8、的配制,母液（储备液）的配制与保存 培养基配制,25,Ms母液（储备液）的配制与保存,26,27,培养基的配制,1、在洁净的不锈钢锅里放入750ml蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。 2、加入储备液1，储备液2、各，按需要量加入植物激素。 3、用蒸馏水定容到1L。 4、调H值。一般. 5、培养基的分装。 6、包扎。 7、培养基的高压灭菌。,28,培养基的灭菌,高温高压蒸汽灭菌：121，1.1Kg/c，15-20芬，时间过长，培养基成分易变性失效 过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类,29,第三节：外植体的选择与培养,主要内容：,外植体的选择 外植体的灭菌 外植体的接种和培养 外植

9、体的成苗途径 污染的原因及预防措施 外植体的褐变及其防止措施 培养物的玻璃化现象及其预防措施,30,一、外植体的选择,1、外植体（Explant）：是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。 2、外植体选择的要求 选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加实用性。 选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。,31,选择合适的大小：根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm之间。 选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料,32,外植体的类型,1、茎尖

10、（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限） 2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。,33,二、外植体的灭菌,外植体的消毒是组培成功与否的第一关键步骤。 外植体的预处理：对外植体进行修整,去掉不要的部分,在流水下冲洗干净. 外植体的表面灭菌： 原则：充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样,34,常用灭菌药剂的使用和效果,35,常用的灭菌方法,(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗-75%酒精浸

11、泡10-20min-无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min-无菌水洗3-4次 （2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸10min-无菌水2-3次-取出种子培养 （3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗-纯酒精漂洗-升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min-无菌水洗3次 （4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟-无菌水洗2-3次-漂白粉上清液浸10min-无菌水洗2-3次,36,消毒注意事项,表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。 在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材

12、料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。 与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。,37,三、外植体的接种和培养,38,（一）外植体的接种-无菌操作,是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。,39,外植体接种全过程,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精灯灼烧,酒精擦拭培养皿,4

13、0,酒精擦拭,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,修剪外植体,41,42,43,（二）外植体的培养,1、光照 2、温度 3、湿度 4、氧气,44,愈伤组织途径：,外植体的成苗途径,如安祖花的组织培养就属此类途径,45,器官发生途径：外植体经诱导后直接形成根和芽，进而形成完整的植物体。如茎尖培养。,46,胚胎发育途径：,47,50年代末期，Steward等人从胡萝卜的韧皮部用液体培养基通过游离细胞的分化，获得了胚状体。据统计，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物已达117种，分属43科，75属 。 培养基的激素成分和氮源影响胚状体的发生。有的植物可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼

14、陀萝、水稻、小麦花药培养；有的植物需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、酸枣、桃等。 在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。,48,五、污染的原因及其预防措施,1、污染：植物组织培养过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养失败的现象 2、污染的原因 一是病原菌污染（细菌、真菌） 二是外植体、培养基、培养器皿带菌 三是操作人员未遵守操作规程。,真菌污染,49,50,51,污染

15、的预防措施,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有： 防止材料带菌-选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施； 防止用具带菌-器皿与金属器械灭菌； 操作室要处于无菌状态-工作室、培养室灭菌等； 操作人员要按照操作程序进行。 在培养基中加入抗菌素 分散接种,52,假设污染率为95%： 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。 得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。 P1（2污）=95% 95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 95%5%=9.5% P3（2得）=5% 5%=0.25% 若得到1

16、支试管的无菌材料，至少要接种： 1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌材料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。,53,六、外植体的褐变及其防止措施,54,褐变,褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象,55,影响褐变的因素,植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变 。 基因型： 外植体的生理状态：一般幼龄材料

17、，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 培养基的成分：培养基中6BA或KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 材料转移时间：,56,褐变的防止措施,选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变 连续转移 加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸； 加活性碳 加多胺类物质，如精胺、亚精胺,57,七、培养物的玻璃化现象及其预防措施,58,玻璃化现象及其产生原因,培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象,59,玻璃化现象的预防措施,适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质,60,培养阶段易出现的其他问题,白花苗,61,62,第四节：试管苗的驯化与移栽,主要内容： 1、试管苗的特点 2、试管苗的驯化 3、试管苗的移栽 4、提高试管苗移栽成活率的途径,63,试管苗的生态环境