凝胶柱层析的操作与应用.ppt

1、第7章：色谱分离技术，第1节：色谱的基本原理和分类，第1部分：色谱分离的基本原理和特征(第1部分：基本原理色谱分离是一种物理分离方法，它利用多组分混合物中每种组分的物理和化学性质的差异，将每种组分以不同程度分布在两相中。(2)色谱分离具有以下基本特征和优点：(1)分离效率高。(2)适用范围广。(3)选择性强。(4)设备简单易操作。缺点：处理量小，操作周期长，不可能连续操作，因此主要用于实验室，很少用于工业生产。(3)色谱的基本概念，1。稳定阶段2。移动阶段3。分区系数和迁移率(或特定的偏移值)4。决议5。正相色谱和反相色谱。运营能力(或交换能力)，2。色谱分离技术分类，1。纸色谱、薄层色谱和柱

2、色谱根据操作形式而定。(2)按流动相分类按流动相色谱的形式分类可分为液相色谱和气相色谱。(3)根据分离机理，可分为1。吸附色谱法2。分配色谱3。凝胶过滤4。离子交换色谱法。亲和层析6。疏水色谱，色谱分离的第二基本操作技术1。柱色谱基本操作技术1。柱色谱的基本装置1。稳定阶段2。移动阶段3。收集系统4。探测系统5。蠕动泵。(2)柱色谱系统的基本操作技术1。正在加载第2列。平衡3。添加样本4。洗脱5。流速控制6。部分集合7。洗脱峰检测和联合收集8。色谱介质的再生。纸色谱基本操作技术1。滤纸2。开发代理3。操作方法4。抗生素的应用3。(1)基本原则(2)吸附剂和展开剂的选择(3)基本操作(1)薄层板

3、的制备(2)样品的预处理(3)取样、显影和显色(4)影响Rf的主要因素(5)薄层色谱的应用(TLC)，第3节吸附柱层(1)吸附色谱的原理和特点。第二，吸附剂的选择除了氧化铝、硅胶和邻苯二酰胺外，常用的吸附剂还包括活性炭。吸附剂种类很多，但吸附剂的选择没有固定的规则，通常需要通过小样本实验来确定。三。吸附柱色谱的基本操作和应用，柱装填，(1)干燥柱装填，在柱的下端加入少量棉花或玻璃棉，然后轻轻撒一层干净的沙子，打开下端口，然后通过漏斗慢慢将吸附剂加入柱中，同时轻轻敲打色谱柱，使吸附剂紧密一致。最后，小心地沿着带有初始洗脱液的壁添加色谱柱，直到它刚好覆盖吸附剂的顶面，并关闭下部端口的活塞。(2)湿

4、柱填料将吸附剂加入适量的色谱中。首先，用洗脱液将其制成稀糊状。首先，打开放置棉花和沙子的色谱柱的下口，然后将准备好的糊状物慢慢填充到色谱柱中。请注意，整个操作应该缓慢，不要将气泡压入吸附剂，始终将溶剂保留在吸附剂上，不要将其排出，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱液刚好覆盖吸附剂平面时，关闭下活塞。三。吸附柱色谱的基本操作和应用，样品装载，(1)湿样品装载首先将分离出的物质溶解在少量用于色谱的洗脱液中，小心地将其添加到吸附剂的上层，注意保持吸附剂的上表面保持水平，打开下开口，当溶液表面与吸附剂的上表面完全相同时，在上面撒一层细砂，并关闭柱活塞。(2)干法取样在大多数情况下，分离的物质很难溶解在最初使

5、用的洗脱液中。此时，可以选择具有高溶解度和低沸点的溶剂，并且可以采取尽可能少的溶剂来溶解它。增加整个操作过程必须注意不要使吸附柱表面的溶液变干，即在吸附柱的上端保留一层溶剂。此外，应该控制洗脱液的流速，并且流速不能太快。如果流速过快，塔内交换不能达到平衡，从而影响分离效果。第4节离子交换柱色谱，1。原则和特点。带电基团与高分子聚合物共价结合，形成能交换离子的带电基团。抗衡离子是与带电基团结合的相反离子，它可以与溶液中的其他离子基团发生可逆交换反应。平衡离子的正电荷离子交换剂可以与带正电荷的离子基团交换，称为阳离子交换剂；带有负平衡离子的离子交换剂与带负电荷的离子基团交换，称为阴离子交换剂。离子

6、交换色谱法是基于各种离子或离子化合物和离子交换剂之间不同的结合力。离子交换色谱的固定相是离子交换剂，它是由一种不溶于水的惰性聚合物基质与一定的电荷基团通过一定的化学反应共价键合而成。(1)离子交换剂的基质(2)离子交换剂的电荷基团根据共价结合到基质上的电荷基团的性质，离子交换剂可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。(3)交换容量交换容量是指离子交换剂交换的离子量，反映了离子交换剂与溶液中离子交换的能力。一般来说，离子交换剂的交换容量是指离子交换剂交换的离子总量，也称为总交换容量，它只与离子交换剂本身的性质有关。离子交换器的选择、处理和保存。离子交换剂的选择取决于分离物质在其稳定的酸碱度下的电荷，离

7、子交换色谱柱的分辨率和流速也与所用离子交换剂的粒径有关。2.离子交换剂的处理和保存：干粉离子交换剂应先膨胀，然后分别用酸和碱浸泡。3.离子交换树脂的选择依据。3.离子交换柱色谱的操作和应用。(1)离子交换柱色谱的操作(1)色谱柱(2)平衡缓冲液(3)装载样品(4)洗脱缓冲液(5)洗脱速度(6)样品的浓缩和脱盐(2)离子交换柱色谱的应用(1)水处理(2)小分子物质的分离和纯化(3)生物大分子物质的分离和纯化(5)凝胶柱色谱(1)凝胶色谱的原理，也称为分子排阻色谱、分子筛色谱或凝胶过滤。它是指当混合物与流动相一起通过固定相(凝胶)色谱柱时，混合物中的各组分根据其分子大小进行分离的技术。固定相(凝胶

8、)是一种不带电的材料，具有三维多孔网络结构。凝胶中每个颗粒的精细结构就像一个筛子。小分子可以进入凝胶网，而大分子被排除在凝胶颗粒之外，因此它具有分子筛的性质。此外，因为整个色谱过程一般不改变洗脱液，它就像过滤一样，所以它也叫凝胶过滤。凝胶类型1。Sephadex 2。琼脂糖凝胶3。聚丙烯酰胺凝胶3。凝胶柱色谱的操作和应用。凝胶柱色谱的优点1。分离条件温和，不易引起生物样品的变性和失活；(2)每次分离操作后，层析剂无需再生即可重复使用；(3)工作范围广，分离的分子质量可以在几亿到几百万之间；(4)设备简单，分离机构简单，易于操作；(5)样品回收率高，几乎达到100%。2.凝胶色谱的缺点是：凝胶色

9、谱的进样量小，操作压力不能高，流速慢。(1)它主要用于脱盐(2)分离(3)分馏(4)生物大分子分子量的测定，(2)凝胶柱色谱的特点和应用，第6节疏水柱色谱，和(1)疏水色谱的原理。尽管蛋白质(酶)在分子内有折叠疏水基团的趋势，并在水溶液中暴露表面上的极性和带电基团，但在蛋白质(酶)的表面上总是存在一些疏水基团或极性基团的疏水部分。这些疏水基团可以与亲水固定相表面的弱疏水基团如短链烷基和苯基相互作用，并被固定相(疏水吸附剂)吸附。各种凝胶过滤介质在与疏水配体偶联后都可以用作疏水吸附剂。常用的疏水配体主要包括苯基、短链烷基(C3-C8)、烷基氨基、聚乙二醇和聚醚。3.疏水柱色谱的操作和应用：(1)

10、疏水柱色谱的操作特点1。色谱柱2的制备。余额3。样品添加和洗脱4。再生；(2)疏水柱色谱的特点及应用1。疏水柱色谱的特点：(1)疏水柱色谱可以直接分离蛋白质和酶等生物大分子溶液，盐析后或用高盐洗脱；(2)分辨率高，流速快，加样量大；(3)疏水吸附剂种类繁多，选择范围广，价格与离子交换剂相当。2.疏水柱色谱的应用：疏水柱色谱适用于任何分离阶段，特别是当样品具有高离子强度时，即盐析、离子交换或亲和色谱后。疏水柱色谱主要用于蛋白质生物大分子的分离和纯化。第7节亲和柱色谱，1。亲和柱色谱原理(1)配体固定化：选择合适的配体与不溶性载体偶联，或以特定的亲和力共价结合到分离介质中；(2)吸附样品：亲和吸附

11、介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与色谱介质没有亲和力，因此不能被吸附和洗掉；(3)样品分析：选择合适的条件，在吸附的亲和介质上解吸酶或其他生物活性物质。(2)亲和吸附介质，亲和色谱的理想载体通常是均匀的珠粒，特别是琼脂糖和交联葡聚糖，但也使用合成聚丙烯酰胺凝胶、纤维素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠。被选作配体的分子必须具有适当的化学基团，这些化学基团不参与配体和生物分子之间的特异性结合，但是可以用于连接配体和载体。亲和吸附介质可以通过将亲和配体共价偶联到载体表面来制备。通常，凝胶过滤介质可以用作亲和配体的载体来制备亲和吸附介质。亲和柱色谱的操作和应用(1)亲和柱色谱的操作特点(1)基本过

12、程(1)进料吸附(2)杂质净化(3)目标产物洗脱(4)柱再生(2)亲和柱色谱的特点和应用(1)亲和柱色谱的特点：在生物产品的分离和分析领域有着广阔的应用和发展前景。亲和色谱因其简单、快速、特异和高效的特点，已广泛应用于生命科学的各个领域。2.亲和层析的应用：(1)各种生物分子的分离和纯化(2)各种功能细胞的分离和纯化(3)各种生化成分的分析和检测，第8节分配柱层析，1。分配柱色谱法的基本原理分配柱色谱法是利用两种不混溶液体之间不同的分配系数来分离混合物。固定在色谱柱中的液体称为固定相，用于冲洗的液体称为流动相。为了固定色谱柱中的固定相，必须有一种固体来吸收它。这种固体本身没有分离效果，也没有吸

13、附能力，但用于保持色谱柱中的固定相。这种固体叫做载体。进行分离时，将含有固定相的载体装入柱中，加入少量分离的溶液，然后用合适的溶剂进行洗脱。在洗脱过程中，流动相与固定相接触。因为样品中的成分在两个相之间分布不同，所以向下移动的速度I(1)当硅胶的吸水率为50%时，它仍为粉末形式。当吸水率超过17%时，硅胶失去吸附作用，被用作载体。这时，硅胶色谱是分布色谱。(2)硅藻土是应用最广泛的载体，因为它具有微孔结构且不吸附。处理和柱装载方法与硅胶基本相似。(3)纤维素；(3)分配柱色谱固定相和展开剂；(1)固定相常用的固定相包括水、各种缓冲溶液、酸性水溶液、甲酰胺、丙二醇和水饱和的有机溶剂等。有时使用“

14、反相色谱法”，即使用有机溶剂作为固定相，而使用水或水溶液或与水混合的有机溶剂作为流动相。(2)显影剂的流动相通常是用水饱和的有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶液。常用的流动相溶剂有石油醚、醇、酮、酯、卤代烷烃、苯等。或它们的混合物。反相色谱中常用的流动相是正相色谱中的固定相，如水、各种水溶液(包括酸、碱、盐和缓冲液)、低级醇等。(1)在装载色谱柱之前，将固定相与载体混合。如果使用硅胶、纤维素和其他载体，可以直接加入固定相进行直接混合。以硅藻土为载体，将硅藻土放入大量流动相液体中，在不断搅拌下逐渐加入固定相。(2)样品添加1。将分离出的物质制成浓缩液，用吸管沿管壁轻轻加入到含有固定相的载体上端，然后

15、加入流动相进行洗脱；2.分离后的溶液被少量含固定相的载体吸收，待溶剂挥发后，加入到层析管载体的上端，然后加入流动相洗脱；3.用略小于管道直径的圆形滤纸吸附分离的溶液，蒸发溶剂，将其置于载体上，然后加入流动相进行洗脱。(1)特点：分配柱色谱具有载体来源容易、分离成本低、流速快的特点，适用于分离极性较大、在有机溶剂中溶解度小的组分或极性相近的组分。(2)应用：分配柱色谱法主要用于分离亲水性成分，如糖苷、糖和氨基酸。第9节气相色谱，1。气相色谱仪的结构和工作过程(1)气相色谱仪的结构1。气路系统2。样品引入系统3。色谱柱4。探测器系统5。温度控制系统6。数据处理系统，(2)工作过程：分离分析前，选择

16、合适的色谱柱和流动相，设定分离操作参数，打开高压气瓶供应载气，载气通过减压阀，样品从进样器注入，载气带入色谱柱。样品中的各组分按照分配系数由载气依次带出色谱柱，进入检测器。检测器将物质的浓度或质量变化转换成电信号，由记录器记录下来以获得色谱图，然后进行定性和定量分析。二是气相色谱的特点，如选择性高、灵敏度高、分离效率高、分析速度快、应用范围广；第三，气相色谱分离条件的选择；第一，固定相的选择；第二，载气流速的选择；第三，柱温的选择；第四，注射量和注射时间的影响；第五，柱形、柱内径和柱长的选择；第四，气相色谱的分析方法。(1)定性分析方法(1)相对保留值的比较(2)增加峰高与已知标准物质的比较(2)定量分析方法(1)校正因子的测定(2)定量方法(5)气相色谱法的应用(1)生物科学的应用(2)农副产品、食品和水中农药残留的检测。(3)分离分析食品中的乙醇等成分、山梨酸、苯甲酸等添加剂以及食品中的污染物第10节高效液相色谱，1。高效液相色谱仪的组成和工作原理(1)高效液相色谱仪的组成1。高压输液系统：储液罐和流动相；高压输液泵；过滤器；梯度洗脱装置2。注射系统：包括取样和注射功能，有三种方法：注射器注射、阀门注射和自动注射器3。分离系统：包括色谱柱和柱温箱。色谱柱内壁抛光不锈钢管主要由柱管、固定相填料和垫片组成。4.检测系统：紫外线，P