ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建

1、Exo III 介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建,答辩人：梁耀极,导 师：韩家淮,一、L I C背景,经典连接克隆方法的极限：,长片段进大载体难度大；,酶切位点有限，受酶切位点限制大。,带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复,L I C,Ligation Independent Cloning,LIC原理,载体和目的片段间，只要带有足够长的同源粘性末端（8bp），经退火，转化E.coil. 即可获得完整的质粒DNA,获得粘性末端,ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3=5的外切酶活性,获得5粘性末端,获得粘性末端,ExoIII

2、全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3=5的外切酶活性： 具有从平末端消化dsDNA的外切酶活性； 具有从5突出端消化dsDNA的外切酶活性； 不具有从3突出端消化dsDNA的外切酶活性。,获得5粘性末端,用ExoIII处理具有同源序列的载体和片段：,Insert,Vector,Insert,Vector,(overlap),(overlap),ExoIII,Anealing,Insert,Vector,在用ExoIII处理载体和片段，获得粘性末端的同时势必会出现两种不可避免情况：,1.,Insert,Vector,Insert,Vector,Gap,2,Inse

3、rt,Vector,Overhang,(cohesive are different in length),(cohesive are different in length),Insert,Vector,获得同源序列,用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获得带同源序列的目的片段和载体。,引物,我们最关注的问题是：,采用ExoIII是否能进行高效的克隆？,二、实验过程,用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的,PET 28a 100ng 4ul,Gene-A3 100ng 1ul,Ddw 4ul,转化、涂板,10Exo buffer 1ul,+Exo III 20units 室温

4、 5min,5 个克隆,寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间,15h,条件优化一,4,60 minutes,条件优化二,25-50ng 载体和片段,条件优化三,Insert/Vestor2/1,最高效的克隆条件,用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系； 4 下反应1h； 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间； 保证目的片段和载体的摩尔比在2/1左右。,最高效的克隆条件,用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系； 4 下反应1h； 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；,载体重建,pBKS pcDNA3.1 pcDNA6 pBOB-CMV,通用序列：（No-tag）,GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC,AGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC,Kpn I,Cla I,EcoR I,EcoR V,Sal I,BamH I,Hpa I,Stu I,Xho I,Bgl II,Hind III,Sma I,Xba I,Sac I,N-terminal,C-terminal