蛋白质组学课件样品制备-中文

1、蛋白质组学,蛋白质组学的基本概念与原理 蛋白质组学研究方法（双向电泳、蛋白质鉴定的质谱方法等） 通过本课程的学习，要求同学了解蛋白质组学的基本原理和方法以及国际上蛋白质组学研究的进展,简介,它是一类重要的生物高分子，参与了生物体内几乎所有的生理功能和代谢过程。,Protein,什么是蛋白质（protein）,蛋白质是由20种氨基酸通过肽键（酰胺键）连接形成的长链分子（肽链），在此基础上，肽链进一步形成二级、三级的空间结构。有的蛋白质还包含辅基成分，如金属铁、锰等。,图：肽链的基本结构,蛋白质的化学结构和特征,蛋白质形成空间结构,由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。

2、,蛋白质组,蛋白质组学,它是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门学科。即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，并对相关蛋白质进行分类和鉴定。,目标：研究蛋白质的功能,2001年，人类基因组序列图谱初稿的公布，但是，基因只是遗传信息的载体，蛋白质才是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。,蛋白质组学研究的历史背景和意义,30000-40000 genes,30000 genes,80% homologous,不同生物基因组比较,生物间蛋白质数的差别 基因数差别 10 1-3,蛋白质组可能是生物复杂性进化的基础,“失之毫厘，差之千里”,蛋白质的多样性,生命的“万花筒”,为什

3、么进行蛋白质组学研究?,mRNA 表达 蛋白表达 (mRN 和蛋白水平 的相关性一般低于50%) 基因顺序无法预测蛋白质的翻译后修饰 一个生物系统的动力学状态通过蛋白质组的变化能更好的反映,与基因组比较，蛋白质组有如下特点,同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；,对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的；,基因组,蛋白组,多样性,同一性,基因组,蛋白组,有限性 无限性,基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，例如人类基因组长度为32亿个碱基对； 对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。,由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包

4、括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量； 对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。,基因组,蛋白组,静态 动态,一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；,个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的； 蛋白质组学研究的一个重要任务是找出蛋白质组里发生变化的蛋白质。,基因组,蛋白组,周期性 空间性,基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；,不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关； 许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在

5、不同的亚细胞环境里运动而发挥作用； 细胞的信号传导和转录调控也常常依赖于蛋白质的变化和运动。,基因组,蛋白组,孤立行为 相互作用,基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰；,蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用； 蛋白质互作的研究有两类：第一类是研究蛋白质相互作用的网络，第二类是研究蛋白质复合体组成。,基因组,蛋白组,单一手段 多种技术,在基因组研究中，DNA测序技术是最基本和最主要的工具，因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务。,在蛋白质组研究中，需要的研究技术远远不止一种，并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术； 蛋白质组研究技术可以简单

6、地分为两大类：蛋白质组分离技术，蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。,蛋白质组学与基因组学研究互补与互助,在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已知基因组的基因数据的比较 蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注释的正确率,“组学”时代 基因组学（Genomics） 转录组学（Transcriptomics） 蛋白质组学（Proteomics） 代谢组学（Metaboliomics） 脂类组学（Lipidomics） ,系统生物学,蛋白质组学分类： 细胞蛋白组学(Cell Proteomics) 结构蛋白组学(Structural Proteomics) 功能蛋白组学(Functional Prot

7、eomics) 磷酸化蛋白组学(Phosphoproteomics) 临床蛋白组学(Clinical Proteomics) 毒理蛋白组学(Toxicoproteomics) ,蛋白质组学,基本生物问题 翻译后修饰 蛋白质-蛋白质相互作用 基因组-转录组-蛋白质组,临床问题 疾病生物标志物-诊断 疾病的机理 药物目标-治疗,确定蛋白质组 鉴定 定量 定位 修饰 相互作用 功能,蛋白质组学,为什么蛋白质组学研究能够得到开展?,新的数据分析技术使蛋白质组学研究切实可行,三个关键技术,分离技术(2维凝胶电泳技术和2维叶向色谱分离技术) 生物质谱鉴定技术 (基质辅助激光解析电离技术和电喷雾电离技术)

8、数据处理和图像分析技术(依靠计算机的数据库和数据处理技术以及凝胶电泳图像分析技术),蛋白质组研究,细胞蛋白质 分离溶解 鉴定 分析蛋白质的结构和功能,1. 蛋白质的宽的动力学范围(PI) 2. 大量的蛋白质是翻译后修饰形成 蛋白质的种类非常巨大 蛋白质的4维行为 (3D 空间位置, 时间),蛋白质组研究中的问题,蛋白质组学-样品制备 Sample preparation,Extraction of protein from tissues and cells is perhaps the most critical step in any proteomics stratage，because

9、 this step influences protein yield, biological activity, and the structural integrity of the specific target protein.,LexA Analog (dra0074) Is a Regulatory Protein That Is Irrelevant to recA Induction， J. Biochem. 2004, 136, 787793,Proteomics Analysis Sample preparation Protein separation Processin

10、g 膜蛋白Membrane protein;核蛋白Nucleus protein; 低丰度蛋白Low abundance protein; 目标蛋白Target protein,(二) 细胞和组织的破碎和蛋白提取方法cell disruption and protein isolation,Solvable sample (可溶性样品),蛋白浓度较高的样品，如血浆，血清，可用适量的样品缓冲液稀释后直接上样；(Blood, blood-serum, cerebrospinal fluid, urine, saliva, tear, bile),蛋白质浓度较低的或含较高盐浓度的样品，如分泌蛋白，在

11、分离前用硫酸铵沉淀、透析或层析法脱盐，再用冻干、对聚乙二醇的透析或用TCA(三氯醋酸)丙酮沉淀的方法进行浓缩。,分泌蛋白质（细菌）的样品制备： A. 细菌培养到一定密度后，4oC下20,000g离心15min; B. 取上清，0.45m滤膜过滤，去除残余的细菌； C. 滤液中加入预冷的25%TCA沉淀蛋白质，冰浴15min; D. 4oC 离心10min E. 10mL丙酮重悬沉淀，清洗2次； F. 冻干沉淀,分泌蛋白质制备应注意： 蛋白质的浓缩和除盐 避免培养基中成分对分泌蛋白质的覆盖； 确保获得足够实验需要的蛋白量；,Sample from tissue (组织样品) 一般的固体组织样品常

12、在溶解缓冲液中破碎，最好的方法是在组织冷冻及液氮温度的条件下破碎，如研钵和匀浆器处理； 特殊的问题：如何解决样品的异质性问题？ （一个组织的不同类型细胞的收集问题） ）基于免疫亲和技术的选择； ）微量切割技术，如激光俘获微切割技术 (LCM), 选择细胞；,Tissues,Grinding- Ultrasonication,Moderately harsh,Vigorous,Dounce homogenizer /Potter-Elvehjem homogenizer /Waring Blendor Homogenizer,-cells broken by shear forces,-soft

13、 animal tissues most animal plant tissues,Moderately harsh-,植物组织样品的制备,1) TCA/丙酮法 用TCA/丙酮溶液沉淀蛋白质, 然后用裂解液溶解沉淀. 优点: 提高了蛋白提取量; 去除次级代谢产物的干扰;使体内蛋白酶失活,避免蛋白降解; 缺点: 由于不充分的沉淀和溶解而选择性地丢失某些蛋白质.,以拟南芥幼叶为例,具体步骤,A. 称取新鲜的嫩叶200mg, 洗净; B. 液氮速冻, 研磨, 加含0.07%巯基乙醇, 10%TCA的丙酮溶液, 低温研磨45min; C. 离心15min, 用0.07%巯基乙醇, 1mM PMSF和2

14、mM EDTA清洗沉淀, 冻干; D. 每10mg 冻干粉中加入250L样品裂解液(9M 尿素, 2%两性电解质, 60mM DTT, 0.5% Triton X-100和0.003%溴酚兰) E. 搅拌,37oC温浴30min; F. 离心取上清,2) 植物组织分级提取法 第一级组分: 疏水性蛋白质; 第二级组分:疏水性蛋白质和核酸结合蛋白; 第三级组分: 与核酸结合紧密的蛋白质;,Sample from Cell (细胞),体外悬浮培养生长的细胞或周期性细胞样品（如红细胞）： 离心收集PBS清洗溶解,固体基质中培养的细胞：,去除培养基质,PBS清洗细胞层,刮檫方法获得细胞，裂解细胞,样品分

15、级 由于真核组织蛋白质表达的高动态范围和多样性，有时必须对蛋白质进行分级处理，降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质 方法： ）亚细胞分级 ）液相电泳 ）吸附色谱 ）选择性沉淀 ）根据在溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性不同，对蛋白质的分级提取,1）温和裂解方法 (细胞,血细胞, 细菌) 渗透裂解（Osmotic lysis） 冻融裂解(Freeze-thaw or osmotic lysis) 去污剂裂解 (Detergent lysis, SDS) 酶裂解 (Enzymatic lysis，溶菌酶, 纤维素酶, 果胶酶, 溶细胞酶),细胞破碎方法,2）剧烈裂解方法 (固体组织, 酵母菌) 超声裂

16、解法 (Sonication) 弗氏压碎器（French press pressure cell） 研磨法（Grinding，mortar and pestle) 机械匀浆法（Mechanical homogenization） 玻璃珠匀浆法,细胞破碎方法,超声波细胞粉碎仪是一种实验室较常见的仪器，它利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡、清洗及加速化学反应等等。,超声波细胞破碎仪 可以用于动植物组织和细胞、细菌、病毒等,原理；它用马达驱动钢体内活塞产生40000psi的压力。 加压样品悬浮液体积高达35ml，以1ml/

17、min的速率穿过针阀。压榨池的内压随着压榨机的压力增大而增大。同时细胞内压力也增加。当样品经过样品出口管时，细胞壁外部压力迅速下降至大气压。细胞内的压力也在降低但是没有细胞外压力下降的快。压力差引起细胞壁膜破裂，释放出细胞内的物质。 该压榨机用来破坏样品细胞壁而将细胞核保留完整。,French实验室压榨机 用于破碎叶绿素，血细胞，单细胞，同类动物组织和其它生物颗粒。,研磨原理：通过碳化钨小球或不锈钢小珠在样品管内来回震荡实现样本的粉碎。可适用于多种样本：包括植物样本、动物样本、细菌和酵母样本。优点：快速研磨，可以在2-4分钟内对48或192个样本进行快速、有效的研磨。操作灵活，每次可粉碎1-1

18、92个样本，可选择24孔或96孔适配板。,Tissuelyser-2细胞破碎仪,(三) 双向电泳常规样品制备及其改进 (Sample preparation of 2D-E),双向凝胶电泳的第一向为等电聚焦（IEF，Isoelectric Focusing）;第二向为SDS凝胶电泳（SDS-PAGE）, 因此，在样品制备的过程中，一切影响等电聚焦和凝胶电泳过程的因素都要考虑在内。 由于实验需求、目的的不同和样品本身的特殊性，没有一种样品制备方法能够广泛地适用于各种各样的样品。需要通过实验摸索最适合的实验条件。有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。,1) 时效性问题（Timely）

19、 2) 亚蛋白质组（subproteome ）： 不同溶解度/生物特异性/疏水性/电荷/亚细胞分布 3) 低丰度蛋白质的预处理 (accumulation of low abundant protein)： 如亲和层析富集 4) 防止降解与人为引入修饰作用（prevent from degradation and modification） 5) 具体对象与后续方法决定制备手段（considering following protocols/kits ）,双向凝胶电泳常规样品的制备程序： 要使用新鲜的样品或者速冻（液氮或-70oC）保存的新鲜样品；注意防止污染；操作过程要在低温中进行，避免蛋白

20、质的降解、修饰。 最简单的培养细胞的样品制备流程如下： （1）常规细胞培养，待长至合适的密度时，更换新鲜的培养液； （2）吸去培养液，用预冷PBS清洗细胞，重复三次； （3）按1106细胞加50l的比例往培养皿中加裂解液(8mol/L Urea,4% CHAPS,40mmol/L Tris,65mmol/L DTT）； （4）进行超声波处理，处理时间为5s,间歇时间为10s,功率为100-200W，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止； （5）4oC、25000g离心1h； （6）取上清液测蛋白质浓度后，分装后-70oC冰箱中冻存。,(1) 在合适的盐浓度下，溶解所有的蛋白质，试验具有重复性； (2

21、)避免低溶解度蛋白(膜蛋白) 在第一维等电聚焦时沉淀； (3)避免蛋白化学修饰(蛋白降解酶，尿素热分解)； (4)去除核酸,多糖,脂类和其它干扰物质； (5)目标蛋白在检测限内，有时需要去除高丰度蛋白,1. 理想的样品制备方法要求如下：,尽量减少可能导致假点的蛋白质修饰, 如不能加热含尿素的样品，因为容易产生异氰酸盐 处理步骤尽量少，并保持冷冻环境；防止蛋白酶的作用,2. 样品溶解(dissolution of sample) 样品溶解是分离蛋白质的最关键因素之一 1)、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏; 2)、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去

22、除； 3)、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,样品裂解液: 为了获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用促溶剂、去污剂、还原剂、IPG缓冲液和两性电解质等将样品变性并充分溶解，这些化学物质应满足一些化学和电学要求。,普遍应用的是用裂解缓冲液: 9.5mol/L 尿素硫脲； 的非离子去污剂NP-40或兼性离子去污剂CHAPS; 1%的还原剂二硫苏糖醇（DTT）; 0.2 % carrier ampholytes SDS不能用于IEF凝胶,3. 样品的还原 蛋白质的二硫键通常用DTT或-巯基乙醇等含自由巯基的试剂还原，但是容易导致蛋白质电泳过程中溶解性丧失； 常用的还原剂有：-巯基乙醇

23、、二硫苏糖醇 (DTT)或二硫赤藓糖醇（DTE）和三丁基膦（TBP）等。 不带电的还原剂如三正丁基瞵取代含巯基试剂增强蛋白质溶解性,二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称为DTT）是一种小分子有机还原剂，其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。,三正丁基瞵(Tributylphosphane ),(reduction of protein sample),离液剂(Chaotropic agent): change and destroy the hydrogen bond, denaturalize protein and de-active the protei

24、n-enzyme (尿素和硫脲, Thiourea and urea). 还原剂(Reducing agent): break disulfur band formed by Cys (DTT, DTE, TBP)，increase the solubility of protein. 去污剂 (Detergent): 破坏分子之间的疏水相互作用，increase the solubility of protein. (SDS, TritonX-100, CHAPS). 两性电解质载体(Ampholyte): increase the solubility of protein.,4. 样品制

25、备常用试剂(Lysis buffer),样品制备中的离液剂（chaotropic agent）,主要作用是改变或破环氢键等蛋白质次级键的结构，使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。 其典型代表是尿素和硫脲。 尿素是最常用的离液剂,它和硫脲联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。 尿素和硫脲可以有效地破坏疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成。,Extraction: Comparison Urea vs Urea/Thiourea,Rat liver,8 M urea,样品制备中的表面活性剂：,表面活性剂（去污剂）：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏

26、水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。主要作用是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。 SDS, Best solubilizing agent known but not compatible with IEF unless diluted into an excess of another detergent. Useful with lipid-rich samples,离子型：如阴离子去污剂SDS等 去污剂的类型 非离子型：TritonX-100, NP-40等 兼性离子型：CHAPS，ASB-14等,kDa,pH,2% CHAPS*,

27、2% ASB C-12*,*Extraction/rehydration also contained 7 M urea, 2 M thiourea, 0.5% Pharmalyte 3-10, 60 mM DTT,7,10,7,10,212,170,116,76,CHAPS vs. Amidosulfobetaine-C12,两性电解质载体(Carrier ampholytes),Carrier ampholytes 作用是促进蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子在离心时还有助于核酸的沉淀，此外，它还可以阻止样品蛋白质和IPG胶条中固相化的两性电解质相互作用，从而提高极性端蛋

28、白质的聚焦效果。 应用时，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。,A，concentration of ampholyte 0 .5%; B, concentration of ampholyte 2%,Three lysis buffer used in 2DE 1. 9mol/L urea, 1%(m/V)DTT, 2%-4% (m/V)CHAPS,2%(V/V) Ampholyte, pH3-10, 10mmol/L Pefabloc 2. 7mol/L urea, 2mol/L Thiourea, 1%(m/V)DTT, 2%-4%

29、 (m/V)CHAPS,2%(V/V) Ampholyte, pH3-10, 10mmol/L Pefabloc (protease inhibitor) 3. Hot SDS buffer: 1%(m/V)SDS, 100mmol/L Tris-HCl, pH7.0. After lysis, diluted in buffer 1 or 2 at least 3 times .,PMSF (1mmol/L) (苯甲基磺酰氟):Most commonly used，inactivates serine and cysteine proteases AEBSF (4mmol/L) More s

30、oluble, less toxic than PMSF, but can cause charge modifications. EDTA, EGTA (1mmol/L) Inhibits metalloproteases 肽蛋白酶抑制剂（Peptide protease inhibitors）Leupeptin, pepstatin A, aprotinin, bestatin TLCK, TPCK (0.1-0.15mmol/L) ，抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶 Benzamidine (1-2mmol/L)，抑制丝氨酸蛋白酶,样品制备中的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor

31、):,硫酸铵沉淀(盐析)，Ammonium sulfate precipitation 三氟乙酸沉淀，TCA precipitation 丙酮/乙醇沉淀，Acetone and/or ethanol 三氟乙酸加丙酮，TCA plus acetone ：比三氟乙酸或丙酮单独效果好,5. 蛋白质的富集(Precipitation) :,三氟乙酸/丙酮,Affinity capture,Co-Immunoprecipitation(IP) or “pull-down” techniques using antibodies directed against one of the component

32、proteins,Under nondenaturing conditions, interacting proteins can be enriched from complex protein mixtures,protein-affinity-interaction chromatography recombinant protein or a chemically synthesized bioactive fragment is immobilized on resin and used as a “probe” to capture interacting proteins dir

33、ectly from a cell extract,影响样品制备的干扰物质, 盐 离子去污剂(SDS) 核酸,脂类及多聚糖 酚类复合物,盐(NaCl): 增加导电性, 使得等电聚焦所需时间延长 出现电内渗现象(EEO), 导致胶内不均匀的水分布(失水区和水过饱和区),核酸: 通过静电作用与蛋白结合,妨碍聚焦过程; 可阻碍丙烯酰胺基质孔道; 多聚糖: 会阻碍丙烯酰胺基质孔道 去除方法: TCA 沉淀法,脂类: 通过疏水作用与蛋白结合, 影响等电点及分子量 蛋白脂类复合物在水溶性溶液中不溶解 处理/去除方法: 在高浓度的去污剂存在下脂类会被聚集而除去, 而蛋白会溶于溶液中, 如富含脂类样品(脑):

34、 采用有机溶剂进行化学去除,酚类复合物(植物): 还原状态: 通过氢键与蛋白结合 氧化状态(醌): 发生共价结合 处理方法: 添加polyvinylpolypyrrolidone (PVPP):形成多酚物 添加还原剂(DTT, 抗坏血酸, 亚硫酸盐),E. coli extract pH 4-7,no salt,30 mM NaCl,6. 除盐方法,除盐,透析（Dialysis）：速度较慢 凝胶过滤（Gel filtration）：蛋白质容易丢失 沉淀（Precipitation/ resuspension）：操作复杂，容易造成蛋白质丢失 complex operation, protein

35、easily lose,Pre-dialysis sample,Dialyzed sample,pH,5,6,6,10,7.5,5,7.5,10,pH,Effect of dialysis,3 h to overnight,PlusOne Microdialysis Kit,2 D Clean-Up Kit for first-dimension IEF,Rat liver extracted with 4 % SDS, 40 mM Tris base,Treated with PlusOne 2-D Clean-Up Kit,Untreated,电泳除杂试剂盒,7. 去除核酸RNA,DNA

36、方法：,核酸对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,通常使用DNase I and RNase A (add 0.1x vol of 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A in 50 mM MgCl2) Nucleases will not work in 8 M urea DNase I will show up on a 2-D map. (pI 5, MW 30 kDa) Benzonase

37、 (both DNase and RNase activity). Sonication,E. coli extract on 7 cm pH 3-10 NL,+ DNase,- DNase,Effect of DNase Treatment,1）应保持蛋白质的最大溶解度和可重复性； 2）选择合适的表面活性剂和还原剂； 3）去除干扰分子和污染,严格防止角蛋白的污染； 4）防止蛋白质在处理过程中的修饰，低温条件制备； 5）裂解液应新鲜制备； 6）样品应保持新鲜； 7) 样品制备方法要与接下来的分离或鉴定方法相适应。 (2DE ; 2D-HPLC) 8) 如果用2维液相色谱分离，太多去污剂和电解质

38、对分离不利。,8. 样品制备注意的问题,防止角蛋白的污染 常见的角蛋白有四种，来源主要是皮肤屑和头皮屑。 实验中一定要佩戴手套，仔细清洗染胶的容器，实验中要穿试验服，切胶在通风橱中进行。,蛋白顺序提取方法(Protein sequence extraction) 原理：根据蛋白质溶解性差异，用具有不同溶解能力的溶解液进行顺序提取，从而提高了样品在2-DE中的可检测范围。(Using different dissolution solution sequence extract, increase the determination limit in 2-DE) 富集低丰度蛋白,如膜蛋白(Enr

39、ich low copy protein, membrane protein) 使用不同的溶剂顺次提取，增加了检测限 1）溶液 A(40mM Tris),提取高溶解性蛋白； 2）溶液 B (8mM urea，4%CHAPS,25mM DTT),提取高疏水性 蛋白; 3）溶液 C(5M urea，2M thiourea ，2%CHAPS，2%SB3-10,2mM TBP) ，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白 每一步可得到1000-2000个蛋白点，顺序提取能够达到10,000个蛋白点,洗, 胶内酶解,MALDI-TOF/TOF (LC-ESI- MS/MS),数据库搜索结果,染色、扫描、图像

40、分析后,切点,分离后酶解,2D-HPLC,酶解,9. 蛋白质样品的酶解 Protein Reduction/alkylation,Reducing:,2-mercaptoethanol, now DTT is the reagent of choice,Alkylating:,4-vinylpyridine, iodoacetic acid(or iodoacetamide),Enzymatic cleavage:,Trypsin: site at Arg and Lys,样品的胶内酶解,试剂及材料准备： 脱色液（银染）：100ml 现配 A液：30 mM储液室温下 铁氰化钾（k3Fe(CN)

41、6） 0.99 g 去离子水 100ml B液：100 mM储液室温下 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O） 2.48 g 去离子水 100 ml 脱色工作液：A与B等体积混合 100 mM NH4HCO3：250ml 室温保存 100 mM DTT还原缓冲液：1ml 现配 (银染不用) 55 mM碘乙酰胺（iodoacetamide）烷化缓冲液：1ml 现配（银染不用） 酶解缓冲液：1ml（含9乙腈（acetonitrile），40 mM NH4HCO3） 胰酶储液：1ml -20 保存，可用4周 冻干的胰酶（trypsin）粉剂20 ug/管（sigma）。溶于100ul 1 mM的HCl

42、，再加入900 ul含9的乙腈（acetonitrile）、40 mM NH4HCO3的酶解缓冲液中。终浓度为20 ug/ml，分装成20ul/管。,胶内酶解：,1)、脱色 去离子水冲洗凝胶，每次10 min，23次（摇床） 用刀片割下的蛋白点置于eppendorf管中，注意尽可能接 近蛋白点以减小背景胶，同时用非蛋白区域胶做空白； 用去离子水冲洗两次后，把胶切成小块（可省）。加入 新鲜制备的脱色工作液，清洗至透明，吸去溶液。,2)、还原和烷化（银染不需要） 样品管中加入90ul 100 mM NH4HCO3 ，50 ul 还原缓冲液 （100 mM DTT），57 保温1 h还原蛋白，室温冷

43、却； 去掉过量液体，迅速加入100ul乙腈脱水，5min后吸去；加 入70ul 100 mM NH4HCO3，IAA烷化缓冲液，室温暗处放置 30 min，使之碘乙酰化反应完成后用100 mM NH4HCO3冲洗 两次，用乙腈脱水，冻干；,3)、酶解 每管抽干的胶块中加入约20ul酶液，置冰上30 min，使其充分吸胀吸胀后将多余的酶 液吸去，再加入20 ul不含胰酶的酶解缓冲液覆盖，37 消化过夜，注意酶解过程中 保持胶块湿润； 4)、萃取 酶解后的上清液移至另一eppendorf管中（可直接用于质谱分析），剩下的胶用50 ul萃取液萃取两次： 90乙腈：10TFA 15 min 超声或sp

44、in（votax一下，静置） 50乙腈：5TFA 15 min 超声或 spin 合并萃取液，冻干后进行质谱分析,(四) 亚细胞水平蛋白组的样品制备 (Subcellular proteomic sample preparation ),1. 亚细胞蛋白质组学：是针对细胞内不同结构区域功能单位的蛋白质组学研究。 根据空间结构、分布和功能不同，分成不同的细胞器或细胞区域，如细胞膜；线粒体；胞浆；过氧化物酶体；细胞核；高尔基体等。,2. 研究亚细胞蛋白质组学的意义(research value),1）富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组（enrich low abundant proteins）；

45、 2）提供蛋白质的亚细胞定位信息(provide location information)； 3）加深对亚细胞组分的结构功能理解（understand the structure and function of subcellular units）; 4) 加深对细胞生理分子机制的理解（understand the molecular mechanism of cell） 5) 亚细胞蛋白质组的差异表达谱（analysis of differential expression pattern of subcellular proteome ）,3.亚细胞蛋白质组学的技术基础,亚细胞组分的分离

46、： 用超离心技术等方法分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。 1）细胞的破碎； 2）亚细胞组分的分步分离：差速离心与密度梯度离心联用；如蔗糖密度梯度离心 3）免疫共沉淀法分离信号复合体（complex）； 4) 亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分； Ca2+鳌合层析住分离大鼠线粒体中的钙结合蛋白 5）分离纯化效果的评价，显微镜检测，或检测合适的标志酶,Subcellular fractionation,Complex isolation organelles,Two main steps :,Homogenization of tissues and cells

47、,Separation of cellular organelles,Centrifugal methods that separate organelles by size and/or buoyant density in gradient,Immuno-isolation methods that use antibodies,Electrophoresis methods that separate proteins on the basis of surface charge distribution,亚细胞定位预测分析,生物信息学的应用：,跨膜片断的判断方法,TMHMM, http

48、:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ Psort, /,Sequence Number of predicted TMHs: 11,4. 细胞膜蛋白质组学(membrane proteomics) 研究进展,Importance，物质、能量、信息的传递 Difficulty,膜蛋白的高疏水性 主要分类： out membrane protein; Peripheral membrane protein; Integral membrane protein;,Proteomics research strategies,s

49、amples(tissues、cell or body fluid),Extract proteins,2D-Electrophoresis, 2D-HPLC,Trypsin digestion,MALDI-TOF/TOF PSD-MALDI-TOF,Q-TOF/ Q-TRAP,HPLC,Trypsin digestion,1D-SDS Electrophoresis,Phosphorylation data analysis,2-DE在膜蛋白分析的应用,新的表面活性剂的应用，提高膜蛋白的溶解性； 新方法，如采用Triton X-144, 或碱性Na2CO3预处理膜蛋白组分，分离内在膜蛋白的技

50、术，有机溶剂抽提膜蛋白等；,Eur. J. Biochem. 2000，267, 2871-2881,Molly等人用碱性Na2CO3预处理技术分离大肠杆菌内在膜蛋白，再用裂解液溶解后，2-DE分离鉴定了21种内在膜蛋白，占预测总内在膜蛋白的80%；,现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,1-DE在膜蛋白分析的应用,非双向凝胶电泳技术的应用： 1）单向SDS-PAGE； 2）质谱对蛋白质或肽段混合物分析鉴定技术的发展； 3）2D-LC-MS/MS技术（Proteomics 2007, 7, 3919

51、- 3931） 4）shotgun技术； 单向SDS-PAGE直接与质谱技术结合分离鉴定膜蛋白质，已成为一种趋势； 其优点：单向SDS-PAGE直接分离膜蛋白避免了等电聚焦过程造成的膜蛋白丢失；,Preparation of outer embrane by sucrose density gradient,solubilization of OM proteins (treatred by sodium carbonate),applied to 1-D PAGE.,In-gel tryptic digestion,applied to 1-D PAGE.,LC-MS/MS, Analysis by Swiss-Prot, grand average of hydropathy,Electron micrograph and protein profiles of purified native OMVs. (A) Negative-staining TEM of purified OMVs after sucrose density gradient centrifugation, showing the homogeneous size of 2040 nm. Bar = 50 nm. (B) CBB-stained S