细胞凋亡和细胞自噬201Xppt课件

1、.,史 娟 医科院基础所 新科研楼607 E-mail: ,细胞凋亡和细胞自噬,.,.,Outline,1. History of apoptosis research 2. Characterization of apoptosis 3. Physiological Significances 4. Apoptosis Signaling Pathways 5. Regulation of Apoptosis 6. Apoptosis and Autophagy,.,第一节 凋亡的研究历史,1842 Carl Voget Initial observation that cell death

2、 in part of normal development 1972 Kerr, Wyllie and Currie- - introduced term apoptosis to describe cell death with a set of common morphological features - Cell deletion was controlled under physiological conditions in adults - Deregulation could lead to many diseases - Morphologically identical t

3、o developmental CD and distinct from accidental cell death,.,1980 Wyllie Biochemical changes in apoptotic morphology: - DNA fragmentation -Requires expression of death genes 1988 Bcl-2 was found to be anti-apoptotic 1991 ced genes were identified in C. elegan 1992 Fas/APO-1/CD95 was identified 1993

4、A role of p53 in regulation of apoptosis was described Fas ligand was identified ICE was found to be homolog of ced-3 in mammalian IAPs were identified 1994 The role of mitochondria during apoptosis 1996 The role of caspases during apoptosis Release of cytochrome c from mitochondria during apoptosis

5、 was discovered 1997 Apafs were identified,.,Nobel Prize 2002 in Physiology and Medicine,Sydney Brenner John E. Sulston Robert H. Horvitz,for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death,.,“Genetic control of programmed cell death in the nematode Cae

6、norhabditis elegans”,“You can observe a lot by watching.” Y. Berra,.,第二节 凋亡细胞的特征,.,凋亡(apoptosis)的形态学特征为染色质凝集、边缘化，细胞皱缩，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞出泡形成凋亡小体。细胞凋亡受到一系列相关基因的严格调控。 程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），即是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动结束其生命的过程，这种死亡由基因决定的。大多数程序性细胞死亡，呈现细胞凋亡的形态学特征。,.,Necrosis,Apoptosis,.,细胞凋亡与

7、细胞坏死在形态上的主要区别,细胞凋亡 细胞坏死,发生条件 多为生理性 病理性（偶然刺激） 单个细胞丢失 成群细胞死亡 细胞膜 发泡，完整 破裂，不完整 细胞器 结构保留 破坏 细胞核 核凝集断裂 核破碎溶解 染色质均一浓缩 细胞 皱缩形成凋亡小体 细胞膨胀而溶解 被邻近正常和巨噬细胞吞噬 残余碎片被巨噬细胞吞噬 炎症反应 无，不释放内容物 有，释放内容物,.,细胞凋亡与细胞坏死在生物化学方面的主要区别,细胞凋亡 细胞坏死,基因调节 由凋亡相关基因调控 与基因调控无关 发生条件 多为生理性 病理性（偶然刺激） 能量 需要能量 不需要能量 新的基因转录 有 无 大分子合成 需要 不需要 Caspa

8、se 依赖性 不依赖 DNA 降解为180-200bp DNA随机性降解成为任意 的整数倍的DNA Ladder 长度的片段 细胞膜 磷脂酰丝氨酸外翻,.,Morphology of Apoptotic Cell,.,Apoptosis,Necrosis,Apoptosis VS. Necrosis,.,.,第三节 细胞凋亡的生理学 病理学意义,.,保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。 维持内环境稳定：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞等。如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话，就会干扰内环境稳定。 防御功能：清除被病原体感染的细胞等。

9、,生理学意义,.,保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。,.,Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis.,Tissue remodeling.,.,脊椎动物的神经系统的发育,.,CTL杀伤靶细胞 。,.,免疫细胞凋亡,细胞凋亡:95%的细胞凋亡 胸腺细胞成熟过程中的凋亡 阳性选择 阴性选择 激活诱导的细胞凋亡：（activation-induced cell death，AICD） CTL诱导靶细胞的凋亡： 穿孔素介导的靶细胞凋亡 Fas介导的靶细胞凋亡,.,ly

10、mphoid progenitor (CLP) double negative (DN) double positive (DP),Apoptosis and survival during T lymphocyte development,.,Apoptosis and survival during B lymphocyte development,.,物理因素：X-射线、热休克等； 化学因素：过氧化氢、乙醇、8氯腺苷、氨 甲蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯碱等； 生物因素：某些细胞因子表达水平变化、蛋白分 子的激活、修饰、降解或构象改变、 活性氧的产生等。,Apoptosis Inducers

11、,.,病原体侵染； 诱导凋亡HIV 抑制凋亡Poxvirus 细胞凋亡不足 肿瘤，自身免疫疾病； 细胞凋亡过度 神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、 再生障碍性贫血、骨组织坏死。,病理学意义,.,HIV infection causes apoptosis,.,第四节 细胞凋亡的信号传递,.,细胞外部刺激信号介导的死亡受体信号传递途径(extrinsic) 细胞内部的信号传递途径 (intrinsic or mitochondrial),.,连接分子（ adaptor）： 具有一些特殊的功能结构域，如 DD、DED、CARD等，同种结构域间具有相互结合的倾向,.,The TNF and

12、 TNFR superfamilies,Aggarwal BB。Nat Rev Immunol. 2003，3(9):745-56,.,CRD：Cys-rich repeats extracellular DD： death domain cytoplasmic essential,.,.,Structure of Death Receptors,胞外区结构相似，有多个富含半胱氨酸保守序列； 胞内区均有特殊死亡功能区（约90个氨基酸残基组成的基序, death domain, DD）； 死亡功能区无任何酶活性，但可与具有相似死亡结构域的蛋白结合。,.,Mechanisms of TRAIL F

13、unctioning,Two functional death receptors (DR4/DR5) Three decoy receptors (DcR1, DcR2 457(7232):981-9.,.,Caspase 1 ICE Caspase 2 ICH-1/Nedd-2 Caspase 3 CPP32/Yama Caspase 4 TX ICH-2 ICErel II Caspase 5 ICErel III Ty Caspase 6 Mch-2 Caspase 7 Mch-3 Caspase 8 MACH FLICE Mch-5 Caspase 9 ICE/LAP6 Mch-6

14、Caspase 10 Mch-4 FLICE-2 Caspase 11 ICH3 Caspase 12 ER apoptosis-specific Caspase 13 ERICE Caspase 14 MICE Caspase 15 Caspase 16 Caspase 17 Caspase 18,Caspases: cysteine aspartic acid specific protease “C” = cysteine, “asp” = cleave after Asp; family of proteases with similar amino acid sequence, st

15、ructure, substrate specificity,.,根据Caspase 家族成员之间大小亚单位的同源性, 可将他们分为3 组: 炎症组（inflammatory mediators）:Caspase1,4,5,12,13,14 凋亡起始组（apoptotic initiators）：Caspase2,8,9,10 凋亡效应组（apoptotic executioners）：Caspase3,6,7,DED: death effector domain CARD: caspase recruitment domain,.,Structure and Function of Casp

16、ases,DED: death effector domains CARD: caspase recruitment domains,.,Caspases are produced as zymogens,Lavrik IN, J Clin Invest. 2005;115:2665-72,.,Scheme of procaspase-8 processing at the CD95 DISC,Lavrik IN, J Clin Invest. 2005;115:2665-72,.,Mechanisms of Caspase Activation,自活化(autoactivation)是指部分

17、Caspase 酶原具有在高浓度或局部高浓度时形成寡聚复合体可自身激活自身的特性。主要为凋亡起始组成员,。 转活化（transactivation）是已激活的起始Caspase 激活其它Caspase 酶原的方式。 非Caspase 蛋白酶活化是Caspase 酶原激活的另一方式。例如Granzyme B。,.,Activation model of caspases,.,How caspases kill,ICAD b. Direct inhibition of caspase activity through active site nitrosylation Bcl-2 protein

18、family: pro- vs. anti-; Caspase inhibitors: a.痘苗病毒CrmA and p35; b. FLIPs; c. IAPs,.,Dual Functions of Caspase-8,Expression and phosphorylation state of caspase-8 in tumors: prognostic marker or to pharmacologically stimulate caspase-8 processing for tumor therapy,Frisch SM Cancer Res 2008; 68:4491-3

19、,.,Signal Transduction by death receptors,Ashkenazi A. Nat Rev Cancer. 2002;2(6):420-30,.,Immunol Cell Biol (2006) 84, 8798,.,Intrinsic Signaling Pathway Activation requires: - Cytochrome c release - ATP/dATP - Apaf-1 - Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/ATP(dATP) apoptosome - Caspase-9 activation,Extrinsic

20、 Signaling Pathway Activation requires: - death receptor - adaptor proteins(FADD/ TRADD) - DISC (death-inducing signaling complex ) - Caspase-8/10 activation,.,Central role of mitochondria in apoptosis,- 线粒体跨膜通道 (permeability transition pore , PT孔) 的开放 - 线粒体跨膜电位下降，Cyt c 释放 - Cyt c/Apaf-1/procaspase-

21、 9/dATP apoptosome - Caspase级联 - Smac释放,.,Structure of Apaf-1,Apaf-1: apoptotic protease activating factor-1,.,.,Inflammasome in inflammation,.,.,Finkel, Science. 2001; 292(5517):624-626.,线粒体PT孔主要由位于内膜的腺苷转位因子ANT和位于外膜的电压依赖性阴离子通道VDAC等蛋白所组成，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和cyt c、凋亡因子AIF等释放。Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作

22、用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。,.,Synergism between extrinsic and intrinsic death pathways by caspase-processed Bid,Cross-talk and integration between death-receptor and mitochondrial pathways Under some conditions cross-tal

23、k is minimalthe two pathways operate independently Caspase processing of Bid induces translocation of processed Bid to mito, where it promotes cytochrome c release,Hengartner, Nature 407: 770, 2000,.,.,Stefan J. Riedl Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 897-907,Pathways to cell death in C.elega

24、ns, Fruitflies and mammals,.,Bcl-2基因家族 IAP家族 FLIP家族 其他：HSP、NF-kB P53,第五节 细胞凋亡的基因表达调控,.,.,Apoptosis Regulators in Bcl-2 Family,.,Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡的发生，结构上拥有保守的BH1BH4的结构域和跨膜区, BH1与BH2结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域，同时在同源或异源性二聚体和离子通道 的形成中发挥重要的作用，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W和Mcl-1等； Bax亚家族：促进细胞凋亡，结构上缺乏BH4结构域，只含BH1BH3和跨膜区，包括 Bax

25、、Bak、Bok； BH3亚家族：促进细胞凋亡，结构上仅具有1个保守的BH3同源结构域，主要包括Bad、 Bim、Bid和Bik等。,Structure and Function of Bcl-2 Family Proteins,Valentijn AJ, Biochem Soc Trans. 2004;32(Pt3):421-5,.,Bcl-2 family-mediated apoptosis,Antiapoptotic members: BCL-2, BCL-XL, A1, MCL-1, etc. Proapoptotics: BID, BAD, BIM, BIK, BMF, NOXA,

26、 PUMA, etc.,.,Models for interaction between BH3-only proteins, BAX/BAK-like proteins and pro-survival BCL-2-family members in signalling in apoptosis.,Strasser A.Nat Rev Immunol. 2005;5(3):189-200.,.,Small molecules convert anti-death factors into pro-death factors,nature chemical biology 2008 12(4

27、):722,.,.,Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs),IAP (XIAP, c-IAP-1, c-IAP-2, Survivin, Livin): to bind with pro-caspase and inhibit the activation of caspases; IAP inhibitors： Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pH), to bind with IAPs a

28、nd activate caspase-9 Omi/HtrA2,.,Structure of BIR domain-containing IAPs,Riedl SJ, Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5(11):897-907.,BIR一般由80个氨基酸残基构成,全称为杆状病毒IAP重复序列( baculoviral IAP repeat),为IAP 抑制细胞凋亡所必需的，也是所有IAP家族蛋白共有的结构域。事实上含BIR结构域的蛋白质在许多真核生物中都可以见到，但并不是所有含BIR结构域的蛋白都能够抑制凋亡。 RING结构是存在于部分IAP蛋白羧基末端的锌指样结构单元

29、。这种锌指样结构具泛素酶活性,能够促进caspase的降解,参与凋亡抑制作用。 少数IAP分子存在CARD结构,是位于IAP分子BIR结构和锌指结构之间的一段序列,目前尚未证明CARD结构与抑制凋亡有关。,.,Molecular mechanism of IAP-mediated inhibition of effector caspases.,Reial SJ et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Nov;5(11):897-907.,.,the Multiple mechanisms of IAPs,Jesenberger V, Nat Rev Mol C

30、ell Biol. 2002;3(2):112-21,.,Krammer PH, Nat Rev Immunol. 2007;7(7):532-42.,Structure of cFLIP (FLICE inhibitor protein) family,DED domain,.,Regulation of NF-kB activation by cFLIP,.,Mathew R, Clin Cancer Res. 2006;12(12):3648-51.,.,Regulation of NF-kB on cell survival and apoptosis,.,热激蛋白(heat shoc

31、k protein，HSP),除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性调节之外，HSP另一重要生理功能是对应激状态下的细胞提供保护。近年来的研究证实HSP蛋白家族的重要成员如HSP90、HSP70及HSP27等可以直接作用于细胞的抗凋亡机制,.,J Clin Invest. 2005;115(10):26332639.,HSP and apoptosis,.,P53 460(7254):529-33.,Modulation of microRNA processing by p53,P53 WT p53-/- after treatment for 8 or 24 h with

32、0.2 g ml-1 doxorubicin,.,Regulation of miRNA biosynthesis by p53,Heiko Hermeking, Nature Reviews Cancer 2012,12,613-626,.,Regulation of p53 pathway by miRNA network,.,Apoptotic signalling pathways and the involvement of miRNA regulation,.,.,.,.,细胞凋亡的检测,.,针对凋亡不同阶段特征的检测方法,1 早期检测 PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 细胞

33、内氧化还原状态改变的检测 细胞色素C的定位检测 线粒体膜电位变化的检测 2 晚期检测 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick-end-labeling） LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) Telemerase Detection (端粒酶检测) 3mRNA水平的检测,.,针对不同位置的凋亡特征的检测方法,细胞凋亡的形态学检测方法 凋亡细胞的光学显微镜和倒置显微镜观察 凋亡细胞的荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察 凋亡细胞的电子显微镜观察 细胞膜相关凋亡检测 线粒体相关凋亡检测 胞浆蛋白

34、相关凋亡检测 Caspase(半胱天冬氨酸酶)活性检测 凋亡相关的非Caspase蛋白酶检测 胞浆其他蛋白活性检测 细胞核相关凋亡检测 其他,.,细胞凋亡的检测方法简述,一、细胞凋亡的形态学检测 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 三、 DNA片断化检测 四、 TUNEL法 五、 Caspase-3活性的检测 六、 WB检测,.,Morphology of Apoptotic Cell,凋亡诱导剂诱导人肺癌细胞株A549发生凋亡，hoechst 33258染色,.,DNA fragmentation and the appearance of “DNA ladder”,.,.,2

35、,.,.,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI,.,Annexin V-FITC Fluorescence,PI Fluorescence,Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium,.,.,.,.,.,.,第六节 凋亡与自噬,.,Various Models of Cell Death,.,Classification of cell death according to the nuclear morphology of

36、the dying cell,Nature Immunology 4, 416 - 423 (2003),.,Classification of cell death according to caspase activation,Necrosis CDCD: Apoptosis, Mitotic Catastrophe, Model of Apoptosis-like, Anoikis CICD: Autophagy, Paraptosis, Oncosis, Model of Necrosis-like,.,Apoptosis and Autophagy,自噬（autophagy）：就其本

37、义而言就是自己吃自己，指细胞在营养缺乏时靠消化自身细胞器而获得能量以度过饥荒的行为。然而，在后来的研究中发现自噬并不只是细胞的一个生存策略，同时也是细胞死亡的一种方式。如在Parkinsons 和Alzheimers 疾病病变的细胞中，经常可以看到细胞自噬的现象。 自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡。自噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解。,“self-killing” “self-eating”,.,J Clin Invest. 2005 Oct;115(10):2679-88.,.,

38、自噬现象最早在哺乳动物中的研究是由Ashford和Porten于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到，但直到1997年日本科学家Yoshinori Ohsumi小组在酵母菌中发现自噬相关基因（autophagy related gene, Atg），对自噬的研究才有新的进展。,.,诱导细胞发生自噬的因素： 饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,.,自噬的特性：1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。 细胞外的：如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等

39、细胞内的：代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等 由于这些因素的经常性存在，因此细胞保持了一种很低的基础的自噬活性以维持自稳。2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体形成，2h后自噬溶酶体基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间，自噬都普遍被保留下来。,.,.,Autophagy pathway and its rol

40、e in cellular adaptation to nutrient deprivation,Levine B, Nature. 2007; 446(7137):745-7.,.,Regulation of the Autophagic Pathway,.,Autophagy in Health and Disease,.,自噬和肿瘤双刃剑,与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。 自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多，相反自噬基因敲除后，增加了化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。,.,自噬与肿瘤,1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境

41、往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。 3）由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬。,.,对不同的

42、细胞，自噬的作用可能不同。 相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。 在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。 肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。 肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。 对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。,自噬与肿瘤的双重关系,.,Conflicting effects of autophagy on cancer,Levine B, Nature. 2007;446(7137):745-7.,.,Immune-related autophagy functions