8高效液相色谱.ppt

1、第八章高效液相色谱8.1概述8.2 HPLC仪器如下：高压注入装置；注入系统分离系统测试系统辅助系统8.3流动相和固定相介绍8.4高效液相色谱法对分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排斥色谱和亲和色谱进行简要说明，8.1概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。可以根据固定相分割：液-液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；大小排斥色谱(凝胶渗透色谱)。还有亲和层析、平板色谱(薄层色谱)等。包括Tswett在内的早期液相色谱在直径15厘米、长度50500厘米的玻璃柱上进行。为了确保恒定的柱流速，填充的固定相粒子直径在150200m范围内更多。但是流速仍然很低(1mL

2、/min)，分析时间仍然很长！如果压力增加流速(真空或空气泵)，则即使分析时间减少，柱托盘高度Hmin也会相应增加！或者柱子效果下降了。为了解决分析时间和柱效果问题，最有效地增加柱效果的唯一方法是减少填充物的粒度(310 m)！1 .高效液相色谱与经典液相色谱的比较快速：HPLC采用高压注入设备，流速大大增加，分析速度非常快，只需几分钟；经典方法通过重力供给完成分析需要几个小时。高效：填充物颗粒很细，有规律，固定相斑点均匀，传质阻力小，柱效果高。几分钟内就能完成数百种物质的分离。高灵敏度：探测器灵敏度极高：UV10-9g，荧光探测器10-11g。2.HPLC和GC的比较分析对象和范围：GC分析

3、仅限于有机物总数的20%的气体和低沸点稳定化合物。HPLC可以分析稳定或不稳定的化合物，该化合物占高沸点、高分子质量和有机物总数的80%。移动相选择：GC在移动上是有限的几种“惰性”气体，它只起到搬运的作用，对组件起较小的作用。HPLC采用的流化床有很多机会混合选择液体或各种液体。它不仅能起到承载作用，还能起到成分作用，与固定相对成分的作用竞争。也就是说，流动相对分离的贡献较大，可以通过溶剂控制和提高分离。工作温度：GC需要高温。HPLC通常在室温下进行。结论：从色谱的发展来看，HPLC比GC更有用，更有发展潜力！8.2 HPLC设备HPLC设备包括：高压注入装置；注入系统分离系统测试系统还配

4、备了梯度浸出、自动注入和数据处理装置。工作流程如图所示。1 .高压注入系统(150350105 Pa) 1)罐：装有溶剂过滤器(Ni合金)的1-2L玻璃瓶，约2米的孔径可防止粒子进入泵。2)脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂从除氧器中去除薄膜，通过阻止相对分子量较小的气体(气泡影响检测)从溶剂中去除。3)高压泵：注入泵要求：密封好，注入流动脉动稳定，可调节范围宽度，耐腐蚀性。注入泵类型：静压和恒流类型。静压泵(类似于波纹管)可以快速获得高压，适用于柱的均匀填充。但是泵腔体积大，往复推进时发生脉动，输出流量随着色谱系统阻力(主要是柱填充物)而变化，因此不再使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱充填无关

5、，常用。机器注入和机器往复两种。最常用的是机械往复式恒流泵(见下图)。每分钟往返25100次，脉动很小。对流量变化敏感的探测器也有噪声干扰。这时可以连接脉动阻尼器。3 .柱1)柱要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱节点的死体积尽可能小。列长1030厘米，内径为45mm(尺寸排除列通常大于5mm，准备列具有更大的内径)；2)柱填充：主要是均匀化方法。根据均质试剂的使用特性，填充方法：填充时用上述方法制作均质浆料，用流动相填充柱及其延长管，将均质浆料倒入均质器，在高压力下快速注入柱。需要充填速度(防止凝结、沉淀或聚集)和进气(影响充填均匀性)。5)电导检测器电导检测器主要用于离子色谱检测。基于某些介质

6、中电离后可能发生的电导(电阻的倒数)变化测量电离物质含量的原理。电导检测器的主要组件是电导池。其响应受温度的影响很大，因此必须将电导池放在温度调节器上。此外，在pH7中，探测器不够灵敏。其他探测器包括MS、IR、evporative light scattering detector、polar等。8.3 HPLC移动相和固定相介绍1，移动相不同于GC流，HPLC移动相参与了搬运作用和固定相的组件竞争，因此溶剂选择对分离非常重要。理想的溶剂必须具有以下特性：1)测量具有一定的极性和选择性。2)与探测器匹配。使用UV探测器时，溶剂截止波长必须小于测量波长(溶剂截止波长低于此波长时，溶剂吸收会影响

7、溶质测量)。使用折射率探测器，溶剂的折射率必须与被测量物体的折射率大不相同。3)高纯度。否则，基线不稳定或产生噪声时，截止波长可能会增加。4)化学稳定性好；5)适当的粘度。粘度过高会增加柱压力。太低容易产生气泡。1 .按压力分类的刚性固体：SiO2为矩阵，内压为7.01081.0109 Pa。可以使直径、形状和孔径不同的粒子。主要用于吸附、分配和结合色谱法。硬质粘合剂：聚合物基(通常通过苯乙烯和二乙烯苯的交联使用)，压力上限为3.5 108 Pa，主要用于离子交换和尺寸排除色谱。2.按孔深度分类的表面多孔：以固体玻璃珠为基质，在基质表面复盖多孔活性物质(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰

8、胺等)的层。表面多孔固定上的大颗粒(着床柱)、小孔层和浅孔(渗透性、峰值速度)；但是交换容量很小。适用于现有分离分析。全多孔：所有硅或氧化铝粒子聚集在一起，粒子非常细，因此光圈小，导电性快，柱效果高。特别适用于复杂混合物的分离。3.根据分离原理：根据分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排斥色谱和亲和层析等，2、固定相载体、8.4高效液相色谱理论分离原理，可以将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排斥色谱和亲和层析等。现在另外介绍一下。一、分配色谱原理：在两种互不溶的溶液中，每个测定物的溶解度不同，分配系数也不同。在热中，由于流动相移动，这种分配平衡进行了多次，每个测量对象的移动

9、速度不同，因此执行了分离过程。2.移动相： HPLC分析表明，为了防止固定相损失，两者不能相互溶解，成为流动相和固定液，或者两者的极性差异越大越好。因此，根据流动相和固定相极性的差异，液相色谱可分为两相分配色谱(流动相极性小于固定相极性，极性小于固定相极性，极性成分分离适合于极性成分分离)和逆相分配色谱(流动相极性大于固定相极性，极性大于大电流，适合于非极性成分分离)。正相色谱：极性移动相c先流出，反相色谱：极性移动相a先流出，中极性移动相，中极性移动相，时间，时间，时间，测量对象极性：ABC，正相，反相色谱的极性和保留时间按照固定相原理，GC中使用的固定相也可以将HPLC用作固定相。但是，H

10、PLC固定液容易脱落，因此以极性为基准，仅高到低，ODPN、聚乙二醇(PEM)、三甲基二醇(TMG)、C18和角鲨烯(SQ)经常使用。根据渍法，固定床可以分为机械渍和化学结合型，后者应用更广。1)机械涂层固定床：通过机械混合将固定液喷射到表面多孔(0.5-1.5%涂层量)或整个多孔载体(5-10%涂层量)上而形成的液相色谱固定床。这种固定相的最大缺点是固定液容易脱落，分离稳定性和再现性差，不适合梯度浸出。为了减少固定液的损失，通常在柱前与分析柱相同，但涂上更高含量的固定液，以在流动相进入分析柱前添加固定液预先饱和的非常短的先行股。2)化学键固定相：化学键固定相是通过化学反应在载体表面结合有机分

11、子形成的支柱填充物，具有稳定、损失小、适合梯度浸出的特点。这种固定相分离机制不是简单吸附或单一液体分布，而是两者。化学键的表面覆盖决定了哪些机制起主要作用。在大多数结合上，分配机制占主导地位。通常，化学键的载体主要是硅胶(表面有硅):Si-O-R:热不稳定性、水、乙醇等强极性水解，导致酯链断裂，因此仅适用于没有水或酒精的流动相。Si-R(或Si-N):不水解，热稳定性优于硅酸质。但是使用的他的反应很不方便。使用水溶液作为流动相时，pH必须在4-8之间。Si-O-Si-R:不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。ii .液固色谱(吸附色谱)原理：根据固体吸附剂活性部位分离不同成分的吸附强

12、度。成分的吸附力强弱取决于吸附剂的表面特性、溶质结构和流动相特性。固定相：固体吸附剂：多孔二氧化硅、氧化铝等；活性炭、石墨炭黑、聚合物微球。应用：溶质分子的结构空间效应和作用对维持值有很大影响，纯结构具有更高的保留度，大量替代物降低了元件的保留度。通常用于异构或顺反异构的分离。第三，离子交换色谱是将离子交换原理与液相色谱相结合，确定各种阴离子和阳离子的分离分析方法的方法。不仅适用于无机离子，还适用于蛋白质、氨基酸、核酸等有机物的分离。1.原理：利用不同测量对象离子对固定相的亲和力(或离子交换力)的差异进行分离。测量对象离子采用离子交换树脂固定相电荷组或自由离子的可逆交换反应：Temporal

13、course，离子交换分离机制，缓慢的中速，色谱分离，一般负离子分离，固定相根据离子交换器类型分为4种，3 .流动相离子交换色谱流动相是具有一定pH和离子强度的盐缓冲溶液，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、有机试剂和配位剂等条件控制分配比k，改变了交换剂的选择性，影响了样品中待测试物质的分离。PH:影响酸或碱的离解平衡，控制成分离子形式的分数。如果元件以分子形式存在，则不会保留。离子得分越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸、醋酸、醋酸、氨等。与离子强度I: pH相比，对保留值的影响更大。成分保留值由流动相中的盐总浓度控制。增加加号和正离子将增加他们对R或R-的竞争力，从而减少成分保留值。添加不同种类的盐会影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和力不同。有机溶剂：添加的有机溶剂通常会降低成分的保留值。极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈、二氧杂环己烷等。配体l:当大量l和成分x沿流动方向进入列时，发生配体交换。RM-L X RM-X L此方法用于分离各种氨基酸或碱类。想法：在离子交换色谱中，流动相经常使用无机盐的缓冲液作为流动相。缓冲液的pH值和离子强度对分离有何影响？离子交换色谱通常用作检测仪吗？4、大小排斥色谱大小排斥色谱也称为凝胶色谱，主要用于大分子分离。这是因为被测量分子的大小和