课题3　血红蛋白的提取和分离.pptx

1、课题3 血红蛋白的提取和分离 第一课时,会理县民族实验中学 唐 贵 燕,本课题教学目标：,1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理； 2.体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求； 3.掌握血红蛋白提取和分离的基本方法。,蛋白质分离的原理,根据各种蛋白质特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识, 凝胶色谱法（分配色谱法）,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）,2、概念：,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,一、基础知识,混合物上柱 洗脱

2、 大分子流动快，小分子流动慢 收集大分子 收集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动,一、基础知识,较 快,较 慢,较 短,较 长,思 考,进行体外实验时，如何保证蛋白质不发生变性呢？,？,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液：,2、作用： 能够抵制（ ）对溶液（ ）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,pH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围

3、内,成分： 磷酸二氢钠和磷酸氢二钠,磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性),4、在本课题中使用的缓冲液？,思 考,如何检验凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？,？,（三） 电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝

4、胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。,（2）原理：,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所

5、带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,课堂巩固,1、凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法： A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度,B,课堂巩固,2关于电泳的说法不正确的是() A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小,C,蛋白质的提取和分离一般分为

6、四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1. 血液有哪些成分？,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,知识回顾,2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤： 2、血红蛋白的释放： 3、分离血红蛋白溶液：,血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸

7、出上清液反复洗涤直至上清液无黄色,在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放,红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）,装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析,透析过程动画演示,（二）凝胶色谱操作-纯化,1、凝胶色谱柱的制作：,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞 安装色谱柱,装配好的凝胶柱,收集得到的纯化后的蛋白,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,课堂巩固 3.下列操作正确的是() A分离红细胞时采用低速长时间离心 B红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D透析时要用20 m mol/L的磷酸缓冲液，透析12 h,D,4有关缓冲溶液的说法不正确的是() A缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B缓冲溶