杀菌剂毒力测定.ppt

1、1、杀真菌剂的生物测定杀虫剂的生物测定，利用病原菌或敏感生物对杀真菌剂的反应来确定杀真菌剂的功效(毒性、功效)。功效、病原、病原生物、毒力、杀菌剂、杀菌剂的生物测定、第二章杀菌剂的毒性试验，室内试验与田间试验有一定的差异。第三章杀菌剂的毒性试验，多菌灵对镰刀菌和镰刀菌引起的赤霉病和恶苗病的室内毒力试验与田间药效一致。然而，多菌灵对棉花枯萎病的室内防治效果较好，而对棉花枯萎病的田间防治效果较差。第三章杀菌剂的毒性试验表明三环唑(黑色素合成抑制剂)在实验室试验中无效。嘧啶类杀菌剂(嘧霉胺)对室内番茄灰霉病菌孢子萌发无抑制作用(300升/毫升)，但对植物番茄灰霉病菌有较好的防治效果(1L/毫升)。(

2、这种药物可以抑制病原菌的甲硫氨酸生物合成和细胞壁降解酶的分泌，从而影响病原菌侵入宿主植物)。5.一、杀菌剂毒性的测定方法。1.孢子萌发法速度快。该方法广泛用于保护剂的测定，适用于抑制病原体能量合成系统和防止孢子萌发的杀菌剂。1.玻璃器皿的处理和清洗：在洗液中浸泡几分钟，用自来水冲洗，用蒸馏水清洗，并擦干灰尘。载玻片储存在70%的酒精溶液中。7.1.杀菌毒性的测定，1.2液体a的附着，混合和滴加。将测试试剂与孢子悬浮液混合并滴加到载玻片上。水溶性药物和稳定悬浮剂可获得正确的结果。对于水不溶性药物，由于快速沉降，很难获得正确的结果。简单快速，适合大规模初筛。测量结果通常较高。8，1。测定杀菌剂毒性

3、的方法，b .定量滴加药液(用水或有机溶剂)形成均匀的药膜，然后滴加孢子液。许多有机溶剂(丙酮、乙醚)具有低表面张力，这使得难以形成均匀的药物膜。因此，应使用凹面载玻片。在防尘条件下干燥。9，1。杀菌剂毒性的测定方法：c .用精确的喷雾装置将药液喷洒在载玻片上，干燥后滴加孢子悬液。1.孢子悬液的制备孢子萌发常用的菌株有马铃薯晚疫病、稻瘟病、小麦赤霉病、甘薯赤霉病、水稻亚麻叶斑病和玉米叶斑病。1.孢子悬浮液的制备真菌只在特定条件下产生孢子。一般来说，繁殖和生长的条件是严格的。改变培养基的组成：首先在高营养浓度的培养基上培养，然后转移到低营养成分的培养基上，这样可以促进孢子的产生。12，1。杀菌毒

4、性的测定方法，1.3孢子悬液的制备，2。不同培养基的选择：植物培养基或植物组织或它们的煎液通常能促进真菌产生孢子。13，1。杀菌毒性的测定方法，1.3孢子悬液的制备，3。培养基的物理和化学性质增加了培养基的酸度，这可以促进一些真菌的孢子产生。在固体培养基上比在液体培养基上更容易产生孢子。14，1。杀菌毒性的测定方法，1.3孢子悬液的制备。病原体的培养条件高温、低温或高低温交替有时能促进孢子的产生。一般来说，半知细菌在光照条件下容易产生孢子。然而，有些细菌在没有光的情况下很容易产生孢子。1.3孢子悬液的制备：一般将培养好的菌种(斜面培养或三角瓶培养)加入无菌水中，用接种环轻轻摩擦表面，将孢子悬于

5、水中，然后用双层纱布过滤，除去菌丝体和培养基碎片。最好用无菌水在离心机中以1000转/分钟的速度清洗三次。通常，孢子浓度为50，000/毫升。10*10观察，每个视野大约有35。16，1。杀菌剂毒力的测定方法。孢子浓度可通过纽鲍尔血细胞计数器测定。边长0.05毫米、深0.1毫米的小正方形，17。1.杀菌剂毒性的测定方法1.4孢子萌发的条件温度：各种真菌孢子萌发的最适温度不同。当温度超过2122时，适合低温的孢子，如小麦黑穗病的厚垣孢子，不能发芽。18，1。杀菌剂毒性的测定方法，1.4孢子萌发条件乙.湿度：真菌孢子一般需要在水滴中萌发，但也有少数真菌孢子，如白粉病的分生孢子，可以在相对湿度很低的

6、条件下萌发。19，1。杀菌剂毒性测定方法，1.4孢子萌发条件C:光照：光照对大多数真菌的孢子萌发影响不大，但能刺激或抑制某些真菌的孢子。例如，光照可刺激稻曲病病原体的厚垣孢子萌发，并抑制小麦秸秆锈病病原体的夏孢子萌发。20，1。杀菌毒性的测定方法，1.4孢子萌发条件D:空气：孢子萌发需要更多的空气，因此水滴表面的孢子比浸泡在水滴中的孢子萌发得更好。然而，玉米黑穗病孢子萌发需要15%的CO2。21，1。杀菌毒性的测定方法，1.4孢子萌发条件D:营养：有些不需要外部营养，有些则必须由外界提供。植物组织煎剂通常是一种促进孢子萌发的物质，其刺激作用是因为它含有生长素或挥发性物质。然而，一些研究表明，促

7、进发芽的物质可以增加孢子对药物的抗性。22，1。杀菌剂毒性的测定方法。一些细菌在蒸馏水中不能很好地发芽，所以可以添加一些促进物质。对于许多病原体孢子，在10毫升孢子溶液中加入0.01毫升0.1%的葡萄糖溶液可以使孢子整齐地萌发。在26下加入少量新鲜玉米苗汁2小时，孢子萌发率高且整齐。23，1。确定杀真菌剂毒性的方法1.5调查方法显微镜检查可在培养20-24小时后进行。通常，显微镜检查进行100-200次，每次处理随机检查200个孢子。孢子萌发标准：当芽管大于孢子的短半径时，考虑萌发。或者以孢子囊产生的游动孢子为萌发标准，如致病疫霉。24，1。杀菌毒性的测定方法，1.5调查方法对照品的发芽率至少

8、在80%以上，如果低于80%，则应重做。25，确定凹玻片上根除病原体的真菌抑制，1。测试对象易产生孢子，便于显微镜检查，如稻瘟病菌、梨状链格孢菌等。将其培养在培养基上，或者将患病组织与水分一起培养，产生孢子以备后用。26，确定真菌抑制病原体孢子在凹面载玻片上消除，2。孢子悬浮液的制备。用去离子水从培养基或患病组织中洗脱培养的真菌孢子，过滤并离心(1000r/min)5min，除去上清液，加入去离子水，然后离心。最后，用去离子水将孢子重悬至每毫升105，107个孢子，并加入0.5%的葡萄糖溶液。27，确定震荡载玻片上病原菌的功能抑制，3。药物的制备，水溶性药物直接用水溶解，其他药物用适当的有机溶

9、剂(甲醇、丙酮、二甲基亚砜等)溶解。)。然后用0.1%吐温80水溶液稀释，设定57个浓度，有机溶剂的最终含量不应超过2%。28.确定真菌对震荡玻片上致病原孢子消除的抑制作用。4.药物处理使药液和孢子悬液在小试管中混合均匀。使用微量取样器，将混合液滴吸到凹面载玻片上，然后放入有浅水的培养皿中，并覆盖水分进行培养。每次处理应重复不少于3次。29，测定真菌对凹玻片上鼠疫孢子消除的抑制作用，5。当空白对照孢子的萌发率达到90%以上时，调查的孢子总数不小于200个，并分别记录萌发数和孢子总数。30，确定真菌对凹玻片上病原体孢子杀灭的抑制，6。数据处理以计算cor31，1。杀菌剂毒力的测定方法。菌丝生长速

10、率试验：将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制作中毒培养基平面，在平面上接种病原菌，根据病原菌的生长速度判断杀菌剂的毒力。32，1。杀菌剂毒性的测定方法。生长率法：病原体容易培养，菌丝生长快，孢子不易产生。棉花炭疽病、红麻炭疽病、禾谷镰刀菌等病原菌具有生长快、整齐、平坦的特点，有利于该方法的测定。33，1。测定杀菌剂毒性的方法，2 .1一般建议在配制有毒培养基时加入9毫升药液，此比例不会影响培养基的凝固。对于加热时易挥发和易分解的药物，应注意培养基的温度，最好在培养基冷却到50左右时加入药物。34，1。杀菌剂毒力测定方法，2 .2。致病菌菌饼的接种方法：用0.4厘米的打孔机打穿菌饼，用接种针或

11、镊子将其放在有毒介质的中心。35，1。杀菌剂毒力测定方法，2 .2标记接种病原菌的接种方法：用接种针蘸取病原菌的孢子液，在接种培养基上画一条直线。培养一段时间后，测量菌丝延伸至垂直方向的长度。36，1。杀菌剂毒力测定方法，2 .3。结果检查和表达方法。交叉测量两个直径，平均值代表菌落大小。37，1。杀菌剂毒力的测定方法。吸附技术这种方法是通过适当的方法将真菌孢子悬液附着在无菌滤纸上，使其与一系列不同浓度的药物接触，然后在一定条件下培养一定时间，然后观察菌丝的生长。38，1。杀菌力的测定方法。用滤纸片附着法(130，1h)对滤纸进行定性灭菌，用70-80%的酒精浸泡20-30分钟，滴加孢子悬液，

12、无菌干燥，用药液浸泡10分钟，放入培养基中。扩散法的基本原理是在接种的琼脂培养基中加入少量抗菌物质，使其与培养基和致病菌接触。经过一段时间的培养，由于抗菌物质的扩散，在接触部分周围产生一个抑菌圈。扩散法广泛用于医疗和农业抗菌物质的筛选和抗菌物质有效成分的定量。40.一、杀菌毒性试验方法；4.扩散法：国际公认的标准抗生素效价试验。将直径为9.0厘米的培养皿保持水平，倒入约20毫升琼脂培养基中，固化后作为底层，然后溶解马铃薯蔗糖琼脂培养基，在5060度下接种被测细菌(细菌、霉菌孢子)，并均匀取少量。41，1。杀菌剂毒性的测定方法。扩散法：将四个牛津杯(外径8毫米，内径6毫米，高10毫米)放在测试平

13、面上。用移液管将已知浓度的标准溶液和不同浓度的待测溶液移入量筒，在适当的温度下培养，形成抑菌圈。测量它的直径。42，1。杀菌剂毒力的测定方法。扩散法：农用抗生素效价的测定抗生素效价有两种测量单位：a .稀释单位，将1毫克抗生素配制成溶液，在一定条件下稀释，抑制其生长的某种细菌的最高稀释度为1毫克抗生素所含的单位。例如，如果1毫克青霉素在一定条件下稀释3600倍可以抑制白色念珠菌的繁殖，1毫克青霉素含有3600个单位。43，1。杀菌剂毒力的测定方法。扩散法：测定农用抗生素的效价。纯抗生素直接用作抗生素功效的测量单位，即1g相当于一个单位。例如，1毫克纯链霉素含有1000个单位。44，1。杀菌毒性

14、的测定方法。扩散法：滤纸法45，1。杀菌剂毒性的测定，5。稀释法(最低抑菌浓度的测定)在液体或固体培养基中，加入一系列的试验溶液，分别注入已灭菌的试管或培养皿中，接种试验菌进行培养，并将能完全阻止细菌生长的最低浓度设定为抗菌能力的指标。该方法也可用于测定抗生素的效价。1.杀菌毒性的测定方法。气体功效测定法一般称挥发性物质的抗菌能力为气体功效。通常，将待测细菌接种在无菌培养皿中的固定培养物上，倒置培养皿，将药物放入盖子中，并用2%豆瓣菜溶液或玻璃纸密封，以研究细菌在合适温度下的生长。47，二。不同杀菌剂的药效试验方法，1。杀菌剂喷洒效果试验1。鲜叶(梨等)孢子萌发试验方法。)，喷洒梨黑斑病病原体

15、的孢子悬浮液，将叶片置于潮湿的培养皿中，在25-28下保持20小时，用龙胆紫或亚甲蓝(0.1%水溶液)染色芽管，风干叶片，并用水涂布。48岁，梨黑斑，2岁。测定不同杀菌剂效力的方法，49，1.1。鲜叶孢子萌发试验该方法也可用于苹果叶片(灰葡萄孢孢子悬浮液)。2。方法测定不同类型杀菌剂的药效，50，1.2叶接种试验在附着杀菌剂的叶片上接种病原菌，观察一定时间后的发病率，以判断杀菌剂的药效。该方法可用于甘薯疮痂病、甘蓝软腐病、小麦叶白粉病等。2.测定不同类型杀真菌剂效力的方法，51。以蚕豆法(Kobayashi法)为例，测定步骤如下：a)用适当的方法在蚕豆成熟叶片(含一对小叶的复叶)的两侧喷洒农药

16、，或迅速将大豆叶片浸入药液中，使叶片完全附着药剂。在室内干燥后，将它们放入保湿培养皿中。b)将在马铃薯和豆瓣菜培养基平面上培养(28) 3天的水稻纹枯病菌(Seyuns sasasakii)冲压成直径为5毫米的小片，将其放置在用药物处理过的叶子中间，并用盖玻片(7m 7毫米)覆盖以进行接种。c)接种后，将叶片置于恒温培养箱(30)中约20小时，然后调查菌丝的生长长度，并确定对菌丝的抑制作用。同时，接种3天后，当对照组的发病面积扩大到全叶表面时，观察药物处理后的病情程度，判断药物的防治效果。52，以蚕豆法(Kobayashi法)为例，测定步骤如下：d)在药物处理前接种病原体，当病叶面积达到全叶面积的1/101/5时(接种后约24小时)取出病叶，用药物处理，干燥，放