质粒目的基因插入及引物设计流程_第1页
质粒目的基因插入及引物设计流程_第2页
质粒目的基因插入及引物设计流程_第3页
质粒目的基因插入及引物设计流程_第4页
质粒目的基因插入及引物设计流程_第5页
已阅读5页，还剩21页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、1.寻找目标基因的基因序列和CDS阅读框(对应于蛋白质的基因序列)。1。选择CDS发育阅读框的基因序列(表达蛋白质的序列)，共162个碱基；2.注意光盘的特点。如果前面的非编码区太长，就需要增加保护序列；如果后端非编码区较长，则表明CDS序列稳定可用；将找到的CDS序列粘贴到新的DNA文件框中，选择线性DNA，软件可以自动分析该序列中可能的限制性位点。2.登录并找到完整的质粒序列，然后将质粒序列粘贴到软件中，将目标基因与质粒的多个克隆位点(即限制性位点)进行比较。1.质粒选择限制性位点的原则：所用酶的限制性位点不能存在于靶基因上，否则靶基因将被切断。质粒上选择的限制性位点应尽可能短，以便为将来

2、其他可能的克隆保留位置。例如，在本实验中，选择了Aflll和BamH1作为质粒，并且在目标基因上没有限制性位点，这是由实验室购买的。可以选择和复制靶基因序列，并将其插入到从AflI到BamHI的序列中，选择特征来命名插入的靶基因UGT1A1。应在目标基因的终止密码子TGA之前添加透明质酸标签(阳性对照蛋白，即如果质粒被转染并成功表达，该蛋白必须存在并可被白细胞检测到)，标签序列应在addgene官方网站上注册以供查询：/mol-bio-reference/genetic-code/, 3。克隆引物设计1。计算机设计：回到NCBI引物blast，复制目

3、标基因的CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入|a|和CDS序列，分别输入1602的最小和最大值(代表blast CDS的所有基因)；手工设计：遵循气相色谱尽可能少，Tm尽可能小的原则，5次结束后选择20左右；从限制性位点的末端算起，3个末端的数目是59，因为在除去CDS框架的20个碱基之后，应该包括HA位点和限制性位点的序列。5-末端引物序列是atggctgtggagtcccag，但添加了保护性碱基AAATATATCTTAAG，最后正向引物是aaatatatttaagatggctggagtccag。tcaacgtaatctggaacatcgtatgggtaatgggtcttggatttg

4、ggct，靶基因的20个碱基，起点(无BamHI限制性位点)和3-末端引物设计的方向，最后应调整引物序列。点击“53”获得反向引物序列tcaagcgtaatctgggaatgggtcttggatttgggct。同时，应在5端位置增加一个保护基AAATATATGGATCC。最终的反向引物序列是aatattggatctcaggtaatgggtcttggatttgggct。构建表达载体的一般过程是设计引物(如上所述，综合考虑透明质酸和CDS序列)，选择合适的样品细胞(本实验中的UGT1A1是肝脏中的一种药物代谢酶，因此最好选择肝细胞系)，提取信使核糖核酸并将其反向转录成cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳凝胶切割回收特异

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论