枯草芽孢杆菌的研究进展#严选内容

1、枯草芽孢杆菌的研究进展摘要枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种具有内源性抗逆孢子的需氧革兰氏阳性杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物表面。其细胞壁不含内毒素，无致病性，具有单细胞外膜，可直接向培养基中分泌多种蛋白质。它是一些重要工业酶制剂的生产商。在营养缺乏的情况下，枯草芽孢杆菌停止生长，但加速代谢，产生多种大分子水解酶和抗生素，并诱导其自身的主动性和趋化性，从而恢复其生长。在极端条件下，它也能诱导具有很强抗逆性的内生孢子。作为革兰氏阳性菌的典型代表，其生理、生化、遗传学和分子生物学研究已有40多年的历史。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为一种

2、基因工程表达系统发展迅速，显示出良好的应用前景。关键词：枯草芽孢杆菌；发起人。绿色荧光蛋白；承运人。表达。异源基因1.枯草芽孢杆菌基因组研究枯草芽孢杆菌具有以下优点： 无致病性，无热原性脂多糖和细胞内毒素，除炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌外，生物安全性好，其中大部分对人畜无害2；遗传特性先进，许多噬菌体和质粒适合作为克隆载体；转化外源DNA的能力系统也适用于转化重组DNA3。蛋白质分泌能力强，当分泌的蛋白质穿过细胞膜时，被加工并直接释放到培养基中，这使得目标蛋白质的回收和纯化更加容易4。良好的发酵基础和生产工艺。枯草芽孢杆菌在工业上长期用于生产苏云金芽孢杆菌的蛋白酶、-淀粉酶和杀虫晶体蛋白。枯草芽

3、孢杆菌可以在相对简单的培养基中生长到高密度。细胞的生长特性和生理特性已经得到了广泛而深入的研究。细胞壁成分简单，仅含肽聚糖和磷壁蛋白，因此分泌的蛋白产物不会与大肠杆菌无法比拟的被膜内毒素(热原性脂多糖)混合.枯草芽孢杆菌的基因表达特征2.1多重西格玛因素原核基因的转录主要由核糖核酸聚合酶完成。该酶由5个亚基、2个亚基、1个亚基、1个亚基和1个因子组成。五个亚单位组成了整个酶，因子被去除成为核酸酶(E)。因子的主要功能是帮助核酸酶识别特定的启动子并结合到转录的起始位置。转录开始后，因子不起作用5。2.2发起人的特征到目前为止，找到枯草芽孢杆菌启动子的方法主要有两种：一种是单一启动子，大多数具有单

4、一启动子的基因在快速生长期表达；另一种是复合启动子，包括串联启动子和重叠启动子。它具有以下特点：两种不同类型的启动子重叠；两种启动子具有不同的转录起始位点或相同的起始位点；启动子可能受时序调控。这些启动子在枯草芽孢杆菌的许多生命现象中起着重要作用，例如感知外部环境的变化、定时调节、孢子形成和萌发6。2.3终结者根据转录终止是否依赖于Rho蛋白因子，大肠杆菌可分为两类，但只有少数基因，如spoOA、gnt和trp操纵子，在芽孢杆菌基因的转录终止方面得到了很好的研究7。它们的终止区都有富含气相色谱的对称序列，基因转录在一串T碱基之前终止。有证据表明，枯草芽孢杆菌使用的终止子在结构和序列特征上与大肠

5、杆菌相似。还发现大肠杆菌在枯草芽孢杆菌中也起作用。2.4芽孢杆菌的核糖体附着位点像其他原核生物一样，枯草芽孢杆菌的限制性商业惯例也包括可降解序列、可降解序列和起始编码之间的间隔区以及起始密码子。芽孢杆菌中最常见的典型序列是“GGAGG”，而大肠杆菌中的典型序列是“AAGGA”。在芽孢杆菌中，大多数基因的起始密码子是AUG，但也发现一些基因是GUG。目前，尚不清楚不同起始密码子的应用如何影响翻译效率8。2.5蛋白质的外分泌大肠杆菌分泌的蛋白质通常分泌在两个细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一个细胞膜，所以它能分泌大量的蛋白质到培养基中。通过计算机分析，枯草芽孢杆菌中有近300种蛋白质的跨膜信号肽位于N端

6、。然而，用于表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表面蛋白。3枯草芽孢杆菌重组表达载体目前，报道了枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐碱芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和短芽孢杆菌，它们独立于芽孢杆菌9。选择不同的芽孢杆菌作为宿主通常具有很强的应用研究目的。3.1质粒载体在枯草芽孢杆菌中，早期质粒载体主要来自其他革兰氏阳性菌，尤其是金黄色葡萄球菌的质粒，其中Pub110、Pc164、pE194等被广泛使用10。它们的主要优点是分子量小、限制性位点独特、拷贝数高，适用于抗性标记

7、的筛选。3.2噬菌体许多噬菌体可用作芽孢杆菌的表达载体，如 105噬菌体、sppl噬菌体等。其中， 105噬菌体应用广泛，其基因组约为39.2 kb。感兴趣的DNA片段可以通过鸟枪实验很容易地分离出来。3.3染色体整合载体将克隆的基因整合到宿主染色体中是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的有效途径。该质粒的组成包括大肠杆菌质粒的复制起点，一个用于选择的抗性标记(如Kan、Em、Cm)，以及一个或两个与枯草芽孢杆菌染色体有一定同源性的序列，也称为交换臂。枯草芽孢杆菌外源蛋白的分泌和表达4.1信号肽和信号肽酶一般来说，枯草芽孢杆菌分泌蛋白可以运输到大肠杆菌的周质腔，而大肠杆菌分泌蛋白的信号肽在枯草芽孢杆菌中

8、很少发挥作用。表明枯草芽孢杆菌的分泌成分对信号肽的结构有特殊要求。4.2蛋白质的分泌表达在枯草芽孢杆菌中，-淀粉酶和一些蛋白酶被大量分泌到培养基中，因此这些酶基因的表达和分泌元件经常被用来构建分泌载体。4.3蛋白质分泌的机制近年来，对枯草芽孢杆菌蛋白分泌机制的认识取得了很大进展。已经鉴定了许多分泌相关元件，并且发现其中一些元件与大肠杆菌的分泌元件具有高度同源性和功能互补性。例如，枯草芽孢杆菌的SecA、SecE和SecY可以代替大肠杆菌的SecA、SecE和SecY发挥同样的作用11。4.4蛋白质分泌的影响因素枯草芽孢杆菌具有很强的分泌蛋白质的能力，但是一些外源蛋白质的分泌通常是低效的。影响蛋

9、白质分泌的因素很多，可以归纳如下：缺乏有效的分子伴侣影响蛋白质的分泌。分泌前，前体蛋白必须折叠成适合运输的构象，折叠过程需要分子伴侣和其他靶因子来完成。对于一些外源蛋白，由于缺乏与它们有效相互作用的分子伴侣，它们不能正确折叠，并在细胞质中形成包涵体。信号肽酶的加工能力影响一些前体蛋白的分泌。信号肽的切除是蛋白质从细胞膜释放的必要条件，而一些信号肽酶的合成受时间序列的调控，这使得一些外源蛋白的分泌受时间序列的控制，这与信号肽酶的合成是一致的。连接在膜外的蛋白折叠促进因子PrsA的量影响外源蛋白的高分泌12。蛋白酶降解导致外源蛋白产量低。细胞壁成为一些蛋白质的分泌屏障。枯草芽孢杆菌的厚壁是一种交叉

10、连接的半多孔结构，主要由肽聚糖和阴离子(如磷壁酸、糖醛酸磷壁金属)的聚合物组成。虽然一些蛋白质可以自由通过细胞壁，但是一些大的蛋白质分子，特别是那些表面带有正电荷的蛋白质分子，可能被细胞壁保留，不能释放到培养基中，或者只有少数被分泌到培养基中。这些影响因素针对不同的目的，它们各自的作用是不同的13。枯草芽孢杆菌外源蛋白的胞内表达枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的研究主要集中在分泌表达，而对其胞内表达的研究较少。发现细胞内表达载体和分泌表达载体的唯一区别是没有编码信号肽的序列。如今，许多高效表达载体的获得为外源蛋白的胞内表达创造了条件。枯草芽孢杆菌研究中的6个问题及发展方向6.1自动蛋白酶的分泌蛋白酶分

11、泌是枯草芽孢杆菌作为表达宿主的限制因素之一。研究发现，在枯草芽孢杆菌中发现了至少27种胞外蛋白酶。这些蛋白酶受时间序列调节，没有底物特异性。当外源蛋白被分泌和表达时，它很容易被蛋白酶降解，从而大大降低产量。6.2质粒的不稳定性枯草芽孢杆菌中外源蛋白高表达的另一个限制因素是枯草芽孢杆菌中质粒的不稳定性。这些不稳定性可分为两类14。6.2.1分离类型的不稳定性。脓毒性不稳定性是指整个质粒从细胞中丢失。需要适当的拷贝数控制来保持质粒稳定，因为ssDNA质粒中没有par基因座。par的功能是在细胞分裂过程中将质粒拷贝主动分布到每个子细胞。没有par功能，子细胞中的质粒依赖于随机分布。如果质粒拷贝数波动

12、，将导致分离不稳定15。6.2.2结构不稳定性质粒结构不稳定的机制可分为两类：模板选择错误；断开和重新连接时出错。解决方法如下：利用多种调控基因和诱导来控制外源基因的表达；(2)克隆的基因整合到染色体中，并随着染色体的复制而复制。这是克服枯草芽孢杆菌质粒不稳定性的有效途径。枯草芽孢杆菌在外源蛋白表达的研究方面远远落后于大肠杆菌，但在活性蛋白的表达和分泌方面明显优于大肠杆菌。实践证明，它能表达多种可溶性和生物活性蛋白质。总之，随着研究的深入，对枯草芽孢杆菌蛋白分泌机制的了解将会更加清楚。相信在不久的将来，影响枯草芽孢杆菌表达系统发展的问题将得到很好的解决。参考刘民生、韩冰、邢新辉。荧光蛋白在枯草

13、芽孢杆菌中的表达J。清华大学学报(自然科学版)，2007，47(6): 874-877。刘伟。芽孢杆菌拮抗菌株的筛选。TasA基因的研究D。福建农业陈、杰森、黄大芳。2植物病害生防芽孢杆菌的抗菌机理及遗传改良研究J.中国植物病理学杂志，2003，33 (2): 97-103。田涛，齐，等.芽孢杆菌的绿色荧光蛋白标记及其在小麦表面的定殖J.植物学报，34 (4): 346-351。刘益强，王亚平，潘乃琪，等。拮抗细菌TG26的鉴定及其抗菌蛋白BI的纯化特性J。植物学报，2005，36 (3): 197-203。姚振生，陈中一，陈至一。绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究J。中国生物技

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