最全面的MTT大汇总(站在丁香园里许许多多巨人的肩膀上)精华

1、我在做音乐电视时走了很多弯路。后来，我在花园里看到了很多建议和指导。当我再次这样做时，结果好得多，我非常感激。所以我总结了很多帖子，希望对后来者有所帮助！同时，感谢你的好帖子！音乐电视大总结实验前需要澄清的问题1.选择合适的细胞接种浓度。一般来说，当96孔培养板的内部贴壁细胞充满时，大约有105个细胞。然而，在进行MTT测试之前，有必要进行预实验以检测不同接种细胞下的粘附率、倍增时间和生长曲线，并确定每孔接种细胞的数量和培养时间，以确保培养结束后细胞被过量填充。通过这种方式，可以确保MTT结晶和细胞数之间的线性关系。否则，如果细胞太多，灵敏度将降低，如果细胞太少，将不会观察到差异。2.药物浓度

2、设置。一定要多阅读文献，参考别人的结果，然后设定一个相对较大的范围进行初步筛选。根据初筛结果，缩小浓度和时间范围，然后进行细筛。记住！否则，您使用的时间和浓度可能根本不是药物的有效浓度和时间。3.设置时间点。测量不同时间点的OD值，输入excel表格，最后得到不同时间点抑制率的变化，绘制变化曲线，当曲线变平时(达到平台期)，该时间点应该是最佳时间点(因为此时细胞增殖的抑制最为明显)。4.训练时间。对于增殖期为10的4 5次方的细胞，200微升的培养基难以维持68小时。如果营养不足，细胞将逐渐从增殖阶段转变为G0阶段，并趋于静止，这将影响结果。我们在48小时内换了培养基。5.MTT法只能测量细胞

3、的相对数量和相对活力，而不能测量细胞的绝对数量。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也会导致MTT比色OD值的增加。6.并非所有的理论都是正确的。根据自己的实际情况。7.实验时应设置调零孔、控制孔和加药孔。将培养基、四甲基偶氮唑盐和二甲基亚砜加入孔中进行调零。细胞、培养基、MTT和二甲亚砜应同时加入到对照孔和药物加入孔中。不同之处在于对照孔中加入了药物溶解介质，而药物添加组中加入了不同浓度的药物。8.避免血清干扰。当细胞在含有15%胎牛血清的培养基中培养时，高血清含量会影响测试孔的光吸收值。随着测试背景的增加，灵敏度将被测试。因此，通常选择胎牛血清含量低于10%的培养基。染色后，尝试吸取培养孔中

4、残留的培养液。实验步骤贴壁细胞：1.收集对数生长期细胞，调节细胞悬液的浓度，向每个孔中加入100微升，铺好平板，将待测细胞的密度调节至1000-10000个孔(边缘孔填充有无菌PBS)。2.5%CO2，37孵育，将浓度梯度药物加入细胞单层底部(96孔平底板)。原则上，药物可以在细胞粘附到壁上后加入，可以是两个小时或半天，但我们通常在前一天放好盘子，第二天早上再加入药物。一般来说，有5-7个梯度，每个孔为100毫升，并设置3-5个重孔。建议设置。3.5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4.向每个孔中加入20微升溶液(5毫克/毫升，即0.5%的MTT)，并继续培养4小时。如果药物

5、能与MTT反应，离心后弃去培养液，用PBS仔细洗涤2-3次，然后加入含MTT的培养液。5.停止培养，小心地吸出孔中的培养液。6.在每个孔中加入150微升二甲基亚砜，在摇床上低速摇动10分钟，使晶体完全溶解。每个孔的吸光度在490纳米的酶联免疫吸附试验中测量。7.同时，设置零调节孔(培养基、MTT、二甲亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的药物溶出介质、培养液、MTT、二甲亚砜)悬浮细胞：1)收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度至1106/ml，依次加入40ul的1640(无血清)培养基，补充；加入10微升放线菌素D(毒性)，用培养液稀释1毫克/毫升，并尝试寻找最佳稀释度(1:10-1:20)；10ul；

6、要检测的对象；将50ul的细胞悬浮液(即5104 cell/孔)和总计100ul的细胞悬浮液加入到96孔板中(边缘孔充满无菌水)。为每个板设置一个控制装置(增加100米(储存溶液100-1640)。2)用5%CO2在37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。向每个孔中加入10微升MTT溶液(5毫克/毫升，0.5%MTT)，并继续培养4小时。(建议悬浮细胞使用WST-1，培养4小时后可跳过步骤4)，通过直接酶联免疫吸附试验od570nm(校准为630nm)测量每个孔的吸光度值4)离心(1000转X10分钟)，小心地吸出上清液，向每个孔中加入100微升二甲基亚砜，并在振荡器上低速振荡10分钟以完全

7、溶解晶体。每个孔的吸光度在酶联免疫吸附测定的od570nm(校准为630nm)处测量。5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的药物溶出介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设置3个多孔。MTT的制备一般来说，MTT目前最好制备，过滤后在暗处保存4C后两周内有效，或者制备成5毫克/毫升，在-20长期保存，以避免反复冻融。最好用小剂量包装，用黑色袋子或黑纸和锡纸包裹，以免分解。我通常把甲氨蝶呤粉末装在试管里。当我使用它的时候，我现在混合它并且直接把它添加到培养皿中。没有必要一次混合这么多，尤其是当MTT变成灰绿色时，它就再也不能使用了。甲基叔丁基醚是致癌的，所以

8、使用时要小心。条件允许时，最好戴透明薄膜手套。制备的MTT应无菌且对细菌敏感；如果你在96孔的盘子上增加时间也没关系。毕竟，时间很短，或者你不放心的时候可以关掉控制台上的灯。制备MTT时，用PBS溶解，有些人用生理盐水在60水浴中帮助溶解。PBS配方：氯化钠8gKcl 0.2g硫酸钠1.44克KH2PO4 0.24g将ph值调节至7.4恒定体积1L关于细胞接种(扩散)30代后不要使用细胞，因为状态不好；培养板应使用好的板(最好是进口板)，坏的板或重复使用的板只能用于预实验。最好按照实验前发现的密度进行接种，因为当细胞密度约为10000/ml时，测得的OD值区间，即细胞抑制率(或增殖率)的线性关

9、系最好，结果最可信。如果细胞扩散得太薄，死亡就不会很明显。如果细胞扩散得过密，它们可能都会死亡，因为细胞生长过快，营养不足，最终导致死亡。如果细胞太密集或太少，增殖就会太快或太慢，并且增殖率的线性关系不好。因此，MTT细胞密度通常为10000/毫升和100微升/孔。细胞密度应根据不同细胞的特性来确定。如果你做的药对细胞有刺激作用，服用一个较小的细胞浓度，如果你做的药对细胞有抑制作用，服用一个较大的细胞浓度，这样与对照的差异就更明显，数据也更好。每孔悬浮细胞数可达105个，贴壁细胞数可达103-104个。其他声音：1.首先，细胞的接种密度不能太大。一般来说，每孔约1000个细胞就足够了。我认为细

10、胞越少越好。尤其是肿瘤细胞。10000/井太高，所以即使药物有效果，MTT法也不能显示出来。最佳点浓度为4000-5000个/孔。如果太小，标清值会很大。2.MTT本身是一个相对粗糙的实验，增殖率在10%左右波动也就不足为奇了。尤其对初学者来说，20%的波动也很常见，所以很可能是技术原因造成的，尤其是板技术必须通过。3.我对生长迅速的肿瘤细胞做了MTT实验。起初，我用100000/毫升的浓度接种它们，但是当细胞生长得太满时，没有梯度，也没有线性关系。后来，我调整了浓度，用40000 80000个/毫升的浓度做了MTT实验。结果表明，浓度在60，000 70，000/ml时效果最好。在40，00

11、0/m的浓度组中，由于细胞少，药物作用仍有梯度，但没有良好的线性关系。根据细胞生长率和药物特性(时间依赖性和浓度依赖性药物)，确定培养时间为48小时或72小时。注意细胞悬液必须混合均匀，这防止了细胞沉淀，导致每个孔中细胞数量不同，因此可以每隔几次混合均匀。加样器应操作熟练，尽可能避免人为错误。尽管移液器比移液器精确得多，但如果您不熟悉操作，变异系数将在8%左右。此外，吹气次数过多也会影响细胞活力。所以，要精通鞋子，并尽快进入董事会。首先，让我谈谈我的经历：1.吹风时，悬浮液的总量不应太多，应为吸管吸量的3-4倍，这样可能更容易混合均匀。10毫升离心管中应装有3 4毫升悬浮液：悬浮液太少容易吹大

12、许多气泡，悬浮液太多不易吹成单细胞悬浮液。2.吸管的抽吸量最好在1毫升左右：如果抽吸量太大，会一次吸入大量的液体，管内剩余的液体会很少，所以吹气时容易起泡，如果抽吸量太小，吹气强度会不够，吹气不均匀。如果是吸管，抽吸量超过1毫升，则液体总体积约为5毫升3.吸液时要在悬浮液的底部，然后稍微抬起，但向下吹气时不要离开液面，否则很容易吹出气泡。4.吹大约100次可以使它变得均匀(有些人认为在加入细胞之前吹30-50次几乎是均匀的。当加入细胞时，每接种2个孔重复吹3次。每打3下后，枪头悬浮在细胞悬浮液中5秒钟，然后以一定的速度吸干悬浮液。)5.不要用枪头太快地将细胞添加到每个孔中，否则你会发现细胞会在

13、添加时由于枪头的冲击而聚集在孔的底部，通常在孔底部的中心，但是周围很少。这种不均匀的分散会导致接触抑制并影响细胞的生长。所以速度不应该太快或太慢。我习惯于在添加每块板后向左移动3次，向右移动3次，来回移动3次，这样细胞可以均匀分散。(铺砌技术是MTT试验的关键和基础，必须认真实践。一些学生用涡流振荡器来混合细胞，最后所有的细胞都死亡了。建议不要用这种方法来混合细胞。添加MTT就我个人而言，我认为MTT的关键是你手机号码的适当比例和你对真正的MTT的参与。特定细胞数和真实细胞数之间的关系很难确定。我认为增加更多的MTT比减少MTT更好。MTT的量因报告而异，通常过量，所以10微升就足够了。如果不

14、使用96孔板，培养基超过100毫升，按10%的比例加入MTT。加入四甲基偶氮唑盐后，摇匀，使四甲基偶氮唑盐与培养基均匀混合，但这应该与它没有什么关系。如果一些孔在加入四甲基偶氮唑盐后立即变成蓝黑色，污染的可能性非常高。此外，建议在加入四甲基偶氮唑盐稀释液后进行过滤灭菌。在添加MTT之前，你可以在镜子下观察是否有细菌污染的洞，这些洞通常就在附近。因为血清中的白蛋白对大多数药物都有结合作用，所以可以将药物和MTT分开加入，看看它们是否会起作用。如果没有反应，可以直接加入MTT，而不是除去含药物的培养液。如何清除上清液百家争鸣：1.在加入二甲基亚砜之前吸收液体，但培养液中的紫色晶体可能被吸收。在此之

15、前，用平板离心机在2000r下离心96孔板5分钟，然后吸收上清液(如果是悬浮细胞，推荐使用这种方法，a2.每次加入MTT后，我再孵育4小时，然后用离心机离心1000g 5分钟。但是用枪小心地吸取上清液仍然会吸出一小部分蓝色晶体。因此，仍然建议颠倒过来！3.此外，板可以直接倒置(用几层滤纸)2-3次，这比“吸”法更难分离细胞。你可以轻敲或倾斜一点来帮助你吸取液体，发现紫色的晶体肉眼几乎看不见，但只有当你自己的细胞牢牢地附着在墙上，并且半附着在墙上的细胞很容易分离。如果药物作用时间较长，阴性对照组可能会因细胞过多而使加入MTT后形成的晶体漂浮，因此上清液不能直接倾倒。4.当进行MTT时，这一步必须

16、小心，不要使用倒置的方法。因为粘附性弱的细胞将被丢弃，这将影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后不要翻板。这种方法杀人。5.加入MTT反应3-4小时后，从培养箱中轻轻取出96孔板，以避免振荡结晶并使其滑动。你可以试着将96孔板倾斜30度，然后用枪尖慢慢吸。一些细胞可以用排枪吸在一起，而其他细胞应该用枪头耐心地吸。枪尖的强度和方向应确保每个孔一致。不要让枪头碰到孔的底部，一旦孔板倾斜，不要反复倾斜和平放，这也会导致晶体脱落。6.如果你用医用注射器和针头吸取液体，你应该把板子斜着放，沿着墙壁吸取！这次，我用1毫升的针头小心地吸出培养液，这比其他方法更可靠，而且一般不会吸走紫色晶体。避免清上清液的改

17、进方法一般来说，能离心96孔板的离心机很难找到。即使当贴壁细胞进行MTT时，DMSO溶解获得的结果也不好，或者没有获得预期的结果，或者重复性差。溶液1:使用以下文献方法：周建军等，用于评估抗癌物质活性的改良MTT法，中国药物杂志，1993，24 (10): 455-457具体方法：用三重溶液：10%十二烷基硫酸钠，5%异丁醇，0.012摩尔/LHCL，蒸馏水溶解。三重溶液：将十二烷基硫酸钠、异丁醇5ml和10M盐酸0.1ml溶于双蒸水，制成100ml溶液操作：在培养板上加入一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如果需要给药，将同时(悬浮细胞)或4小时后(贴壁细胞)加入10ul/不同浓度的药物孔，并设置三个多孔。此外，每个平板没有归零孔(只添加培养液，不添加细胞和药物)。培养2天后，加入20ul/MTT溶液/孔，继续培养4小时，然后加入100ul/三重溶液/孔，在37静置过夜，用微量板读数器测量每个孔的A570值。优点：简化操作，提高可靠性。解决方案2:日本同事有一种新的试剂CCK-8，可用于简单而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理是该试剂含有WST-8其化学名称是：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，即在电子载体1-甲氧基-5-甲基中产生的的量与活细胞的数量成