基因编辑技术的概念和原理.ppt

1、基因编辑技术的概念和原理，什么是基因编辑技术？基因编辑是指基因组定点修饰的新技术。利用这种技术，我们可以准确地定位基因组中的某个位点，并在该位点切下靶基因片段并插入一个新的基因片段。这一过程不仅模拟了基因的自然突变，还对原始基因组进行了修改和编辑，从而真正达到了“编辑基因”的目的。在基因编辑的研究背景下，传统的动物育种方法受到种源的限制，需要大量的人力、物力和财力，并且要经过漫长的培育过程。此外，不同物种间的杂交非常困难，而且很难在育种成果上取得突破性进展。在现代动物分子育种中，分子标记技术可以定位与经济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关系，从而快速、可靠地筛选动物后代。然而，利用分子

2、标记技术辅助筛选，其改良程度仍然受到品种现有基因的限制。因此，利用基因工程技术改良品种可以突破种源的限制和种间杂交的瓶颈，获得新品种，因此分子育种更加必要和直接。目前，获得突变体的常用方法是利用T- DNA或转座子构建大规模随机插入的突变体库，但构建覆盖整个基因组的饱和突变体库需要大量的工作和时间。通过定点突变完全灭活靶基因来研究特定基因的功能是最直接有效的方法。近年来，随着高特异性、可操作性人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因组编辑技术发展迅速，靶向基因操作被推向高潮，使靶向基因敲除和敲入变得更加简单和高效。与基于同源重组和胚胎干细胞技术的传统基因打靶技术相比，新的基因编辑技术保留了定点修

3、饰的特点，能够以更高的效率、更短的构建时间和更低的成本应用于更多的物种。基因编辑的原理和现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即通过特定的DNA双链断裂激活细胞的自然修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)。根据基因编辑原理，非同源末端连接(NHEJ)是一个低保真度修复过程。在断裂的DNA的修复和重新连接过程中，会发生随机插入或碱基丢失，导致移码突变，从而使基因失活并实现目标基因的敲除。如果存在外源供体基因序列，NHEJ机制会将其连接到双链断裂的DSB位点，从而实现靶向基因敲入。基因编辑原理，同源重组修复是一个相对高保真的修复过程。在存在具有同源臂的重组供体的情况下，供

4、体中的外源靶基因将通过同源重组过程完全整合到靶位点，而没有随机的碱基插入或丢失。如果DSB同时在一个基因的两侧产生，那么在同源供体存在的情况下，原始基因可以被替换。目前，基因编辑技术主要有三种，即：人工核酸酶介导的锌指核酸酶(ZFN)技术；转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术；核糖核酸引导的CRISPR- Cas核酸酶技术。1.ZFN基因组编辑技术、ZFN技术是第一代基因组编辑技术，其功能是基于锌指蛋白开发的，具有独特的DNA序列识别功能。1986年，Diakun等人首次在真核转录因子家族的DNA结合区发现了Cys2- His2锌指模块，1996年，Kim等人首次将锌指蛋白与核酸内切酶人

5、工连接。2005年，Urnov等人发现一对由四个锌指连接的ZFN可以识别24 bp的特定序列，从而揭示了ZFN在基因组编辑中的应用。ZFN由锌指蛋白(ZFP)和Fok核酸内切酶组成。其中，由ZFP组成的DNA识别结构域可以识别特定位点并与之结合，而由霍启东组成的切割结构域可以发挥剪切功能，两者的结合可以断裂靶位点的双链DNA(DSB)。因此，细胞可以通过同源重组修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复DNA。HR修复可能恢复或插入靶位点，而NHEJ修复则容易发生插入突变或缺失突变。两者都会引起移码突变，从而达到基因敲除的目的。ZFN诱导的基因组编辑技术可以应用于许多物种和基因位点，具有

6、良好的发展潜力。然而，目前有三个缺陷制约着这项技术的推广。(1)设计与现有战略高度契合的ZFN需要大量的工作和时间；(2)ZFN在细胞中的持续表达对细胞是有毒的；(3)虽然三联设计具有一定的特异性，但仍存在不同程度的偏离目标效应。2.TALEN基因组编辑技术。2009年，研究人员在植物病原体黄单胞菌中发现了一种转录激活因子样效应物。其蛋白质核酸结合结构域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列具有相对恒定的对应性。随后，TALE对DNA序列的特异性识别被用于替代ZFN技术中的锌指蛋白。它具有较强的可设计性，不受上下游序列的影响，比ZFN具有更广泛的应用潜力。TALENs含有两种TALEN蛋白，每一种都

7、是由TALES阵列和Fok融合而成。一个TALEN靶向正义链上的靶位点，另一个靶向反义链上的靶位点。然后Fok形成一个二聚体，该二聚体在靶序列中间的间隔区切割DNA，导致双链DNA断裂。然后，细胞开始DNA损伤修复机制。不同TALEN骨架的最佳间隔长度不同，其长度范围一般为1220 bp。实验结果表明，当第一个碱基为T时，TALENs具有更好的结合效果。目前，TALEN已成功应用于酵母、哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶，与锌指核酸酶系统相比具有很大的应用优势，但仍存在一些问题需要解决，如：的离靶效应、TALEN与基因组的特异性结合与染色体位置和相邻序列有关等。3。CRISPR /Cas9基因

8、组编辑技术。1987年，Ishino等人在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶基因附近发现了串联间隔重复序列，然后发现该间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，这种重复序列与细菌获得性免疫之间的关系终于在2007年得到证实。在这个系统中，能够识别外来基因并仅用一个核糖核酸将其降解的功能蛋白质引起了研究人员的兴趣。直到2012年，Jinek等人首次使用CRISPR /Cas9作为体外可编辑的短核糖核酸介导的核酸内切酶系统，这标志着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的成功出现。3。CRISPR /Cas9基因组编辑技术，CRISPR /Cas系统由Cas9核酸内切酶和sgRNA组成

9、。转录的sgRNA折叠成特定的三维结构，并与Cas9蛋白形成复合物，引导Cas9核酸内切酶识别特定的靶位点，切割PAM序列上游的DNA并导致双链DNA断裂。启动DNA损伤修复机制。从不同菌株中分离的CRISPR/Cas系统的CrRNA(或人工构建的sgRNA)靶向序列长度不同，PAM序列也可能不同。三种不同技术的比较，续表，新基因编辑技术的应用，基因功能的研究，基因治疗，模型动物的构建，新品种的转化和培育，1。在基因功能研究中，基因敲除是验证活体动物基因功能的一个必不可少的逻辑环节，但传统的基因敲除方法需要复杂的靶向载体构建、胚胎干细胞筛选和嵌合动物模型培育等一系列步骤，其成功率受到诸多因素的

10、限制。1.基因功能的研究，即使对于技术成熟的实验室来说，用传统技术在老鼠身上敲除一个基因通常也需要一年以上的时间。基因编辑的新技术并非如此。基因敲除高效、快速，是研究基因功能的有力工具。1.基因功能研究：ZFN技术已成功实现了模型生物或经济物种(如大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草和人类细胞系，包括诱导多能干细胞)细胞或胚胎中内源基因的定点突变，其中在果蝇、斑马鱼、大鼠和其他物种中也获得了稳定的基因突变。2009年，许多机构(如威斯康星医学院、桑加莫生物科学公司和西格玛-奥尔德里奇公司)成功培育出首个目标基因敲除2.基因治疗传统的基因治疗是将正常的基因片段导入细胞以替代缺陷基因，但这

11、种方法难以精确控制，且可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以准确定位、纠正或去除目标位点的基因，达到基因治疗的目的。2.基因疗法，贝克曼等人使用TALEN技术从患者的线粒体中去除患病的DNA。这是TALEN首次应用于线粒体基因编辑，这项研究有望用于治疗母体线粒体疾病。2.基因治疗方面，李等人利用技术在染色体精确定位方面的优势，通过“切割”和“粘贴”基因实现了对实验小鼠的血友病治疗，避免了传统基因治疗带来的插入突变风险，并首次在基因治疗的基因组编辑方面取得突破。3.建立以人类疾病为基础的模型动物和动物模型，对研究这些疾病的发生和治疗具有重要意义。基因打靶技术是在胚胎干细胞和同源重组技术的基础

12、上发展起来的。模型构建费时费钱，模型动物的选择受胚胎干细胞的限制。基因编辑新技术不受胚胎干细胞的限制，效率高、速度快、定点编辑更准确，可以在各种细胞和生物的特定位点进行切割和修饰。第一个构建转基因小鼠的人Jaenisch和他的同事最近利用CRISPR- Cas系统构建了一个具有特定突变的小鼠模型。3。构建模型动物，4。改革和培育新品种。传统的转化动植物品种的转基因技术是将外源基因片段插入受体基因组，转化基因功能，使其表达优良性状，获得人类所需的品种。基因编辑技术可以进行定点修饰，实现高效定向。Shukla等人修饰了玉米中的1(肌醇磷酸激酶1 (IPK1)基因，使其对除草剂更具抗性，并且肌醇磷酸

13、在发育中的种子中的表达谱如预期的那样发生了变化。Townsend等人瞄准了烟草中乙酰乳酸合成酶基因的SuR (SuRA和SuRB)位点，培育了对咪唑啉酮除草剂和磺酰脲类除草剂具有抗性的新品种。基因编辑的不足是一项新技术，存在结构复杂、价格昂贵等问题，其非目标效应限制了其在基因治疗和其他应用中的发展。随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能的研究成为后基因时代的焦点。基因编辑技术不仅可以用正常基因代替突变基因进行性状改良和基因治疗，还可以用突变基因代替正常基因进行基因功能研究。与传统的基因打靶技术相比，基因编辑技术摆脱了对胚胎干细胞的限制，可以应用于更多的物种，定向修饰更精确，效率更高，时间更短，获得的突变可以通过种系遗传。其中，CRISPR系统可以同时切割多个靶标，并且容易获得纯合突变体。基因编辑技术的前景、与基因组编辑技术相对应的友好位点的选择