第2章-细胞工程实验室组成及无菌操作技术.ppt

1、第二章 细胞工程实验室组成及无菌操作技术,第一节 细胞工程实验室组成 第二节 无菌操作技术 第三节 培养基组成及其配制 第四节 实验室生物安全,第一节 、细胞工程实验室组成,一、实验室组成 二、基本设备及使用 三、培养器皿及实验用具,细胞工程实验室应满足三个最基本的需要： 实验准备； 无菌操作； 控制培养。,此外，根据实验目的进行观察、分析和操作等其它配套。,一、实验室组成,一、实验室组成,1基本实验室 准备室/化学实验室 接种室/无菌操作室 培养室 2辅助实验室 细胞学实验室 生化分析室 摄影室及暗室 3. 移栽设施/温室,1基本实验室,准备室/化学实验室:功能： 就是进行一切与实验有关的准

2、备工作。要求： 宽敞明亮，通风条件好 ，地面便于清洁并应防滑处理。,基本的设备：工作台、药品柜、冰箱等、培养基分装器、蒸汽压力灭菌锅等。,接种室/无菌操作室： 功能：是进行接种、继代、细胞融合等无菌操作的场所。 要求：封闭性好，干燥清洁明亮，防止空气对流。外应设缓冲室、更衣室 。,基本的设备：超净工作台（接种箱）、电热灭菌器、喷雾消毒器、紫外灯、酒精灯等。,培养室 功能：是对接种到培养瓶的离体材料进行控制培养的场所。 要求：是要能控制光照和温度，应保持干燥和清洁，防止微生物感染。,培养室基本设备：培养架、摇床、光照培养箱、通风设施、时间过程控制器、空调机、加湿器、除湿机及温度感应器等。,2辅助

3、实验室 根据具体的实验需求而定。 细胞学实验室 生化分析室,3.移栽设施/温室 驯化室、 温室：主要用于试管苗炼苗与移栽，面积大小视生产规模而定。 要求：配置人工光源并且能够控制室内温度，为试管苗的正常生长提供适宜的环境。,实验室布局的基本要求是： 便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,二、基本设备及使用,1.无菌操作设备 2.培养仪器设备 3.细胞学观察设备 4.化学实验常规设备 5.其它仪器设备,1.无菌操作设备 （1）无菌接种设备：超净工作台、接种箱,水平送风,垂直送风,（2）灭菌设备： 高压蒸汽灭菌锅、过滤灭菌装置、干热灭菌烘箱/消毒柜、喷雾消毒器、紫外灯等。,高压蒸汽灭菌锅,过滤

4、灭菌装置,微孔滤膜滤器,玻璃漏斗式滤器,不锈钢过滤器,干热灭菌箱/烘箱,电热灭菌器,2.培养仪器设备 培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。,3.细胞学观察设备,应备有普通显微镜和倒置显微镜。,4. 化学实验常规设备,主要用于试剂保存与称量、培养基配制与分装和水处理等，根据实际需要予以配置。 冰箱、天平、酸度计、离心机、加热器、纯水器、分装设备等。,5.其它仪器设备 光温控制设备、生化分析设备、细胞流失仪、细胞融合仪、显微操作仪、摄影器材、温室设备等。,三、培养器皿及实验用具,1、培养器皿： 试管 适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。 三角瓶 适用于各种培养。 L形管和T形管 为专用的旋

5、转式液体培养试管。 培养皿 适于固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶 适用于单细胞和原生质体的浅层液体培养。 果酱瓶 常用作试管苗大量繁殖。,2、计量器皿：吸管、量筒、容量瓶、移液器（刻度移液管、微量移液器）等 3、盛装器皿：烧杯、试剂瓶等 4、接种工具：镊子、剪刀、解剖刀、接种针、酒精灯等。 5、新型材料器皿：塑料培养瓶、封口膜等 6、分注器,第二节、无菌操作技术,一、实验器皿及洗涤 二、灭菌和消毒的方法 三、植物无菌操作的一般程序,一、实验器皿及洗涤,1、玻璃器皿 常用的各种规格的培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。,浸泡： 清水、5%稀盐酸 刷洗：软毛刷蘸洗涤剂 酸

6、洗：铬酸洗涤液 冲洗：自来水冲洗、蒸馏水漂洗,2、塑料器皿,主要有多孔培养板、培养皿及培养瓶等。,自来水浸泡冲洗、晾干，再用3% HCl或2% NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗后用蒸馏水冲洗3次以上，晾干备用。,3、金属器材,主要为镊子、剪刀、解剖刀等解剖、取材、剪切组织及接种材料等的工具。,新的金属器材：先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉溶液煮沸，或用1%NaHCO3煮沸15 min，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121高压蒸汽灭菌20 min。 已用过的金属器材：灼烧消毒或高压蒸汽灭菌消毒。,4、滤 器,玻璃滤器：与玻璃器皿清洗相同。无论是水浸泡还是酸浸泡，都可用抽滤法

7、。 不锈钢滤器：使用后弃去石棉滤膜，金属部分刷洗干净，最后用蒸馏水漂洗23次，晾干备用。 微孔滤膜滤器：使用后弃去微孔滤膜，滤器用清水充分冲洗，最后用蒸馏水漂洗，晾干备用。,灭菌和消毒是组织培养重要的工作之一 。 灭菌(sterilization)：是指用物理或化学的方法，杀灭或清除传播媒介上的所有微生物，使之达到无菌程度。 消毒（disinfection）：是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。,二、灭菌和消毒方法,干热灭菌法： 湿热灭菌法： 过滤除菌法： 紫外射线消毒法： 灼

8、烧灭菌： 熏蒸消毒法： 消毒药剂消毒法： 抗菌素抑菌法：,化学方法,物理方法,以上方法要根据不同材料、不同目的适当的选用。,1、灭菌和消毒方法,干热灭菌法：利用烘箱进行烘烤灭菌的方法，适于玻璃器皿和金属器械的灭菌。 一般器皿：150，40min，或120，2h可达灭菌效果。 细菌芽孢：160 ，持续90120min。,湿热灭菌法： 利用高压蒸汽锅进行的灭菌方法。常用于培养基、蒸馏水的灭菌，也适用于各种玻璃器皿、棉塞、滤纸、金属用具等。可有效缩短灭菌时间，灭菌效果好。 一般设定为： 压力：0.1Mpa （ 1.01.1kg/cm2 ） 温度：121 时间：维持2030min。,培养基一般用湿热灭

9、菌法：,培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。 灭菌后的培养基储藏在410的条件下，2周内可使用。,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。,过滤除菌法：利用微孔滤膜过滤除菌，用于一些遇高温高压易分解或失效的物质的除菌。 如：经高温灭菌后GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。 抗生素、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌，否则会失去作用。,绝大多数细菌和真菌的直径在0.520m，滤膜孔径应在0.45m以

10、下，一般在0.250.45m之间。,培养基中含有需要过滤灭菌的物质时，可将除这种化合物之外的全部培养基装于一个三角瓶中进行高压灭菌，然后置于超净工作台上的无菌条件下使之冷却至40左右。然后将这些化合物溶液过滤灭菌，再将之加入经高压灭菌过的培养基中。,紫外射线消毒法：用紫外灯照射消毒的方法，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。 适用于实验室空气、操作台面、试管受精时所用的花粉等，一般照射时间1520min。,灼烧灭菌：用酒精灯灼烧以达到灭菌目的，常用于接种器械、瓶口等。电热灭菌器，灭菌炉加温后最高可达350。 金属用具放在75的酒精中浸一下，然后放在火焰上

11、燃烧灭菌，在无菌操作过程中要反复进行。,熏蒸消毒法：用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。 如：向甲醛中加入高锰酸钾，促进甲醛的快速挥发而起到灭菌；或为避免材料中毒死亡，培养间可改用乙二醇加热熏蒸的方法。 适用于接种室、培养间的灭菌。,消毒药剂消毒法：化学消毒剂使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解，以至细菌死亡。 常用的有7075酒精、升汞、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢等。 利用不同的消毒剂可以对器皿、操作台面、皮肤、实验材料等进行消毒的方法。,抗菌素抑菌法：利用抗生素对实验材料进

12、行抑菌的方法。 常用的有：青霉素、链霉素、新霉素、利福平、卡拉霉素等。,三、植物无菌操作的一般程序,1、外植体选择 2、外植体的表面消毒 3、材料的接种 4、材料培养 5、培养物的观察与分析,植物基因型 外值体来源 外值体大小 取材季节 外值体的生理状态 外植体的发育年龄,1、外植体的选择,依据培养目的、植物的特性而定。适宜的外植体的选择要通过实验确定。,2.外植体的表面消毒,各种外植体的消毒方法,（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒 （2）果实及种子的消毒 （3）花药的消毒 （4）根及地下部器官的消毒,根据外植体类型，选择适当的消毒剂，使用适当的浓度、适宜的处理时间和处理方式等。原则上要保证达到一

13、定的灭菌目的，还要保持植物组织和细胞的活性。,接 种：是将已消毒好的材料如根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。 接种程序： 接种工具灭菌-材料切割-转入培养基-培养瓶封口,3、材料的接种,超净工作台的准备： a. 上超净工作台前先打开送风系统，70酒精清洁内部各面； b. 放入需要的各种用具、物品及培养基等，以70酒精喷洒或擦拭表面； c. 打开紫外灯，20-30min后关闭紫外灯，上台操作； d.上工作台后，用75酒精棉球认真擦拭双手； e.开始外植体的消毒； f.接 种； g.接种结束后，清理和关闭超净工作台。,4、材料培养,初代培养：诱导外植体生长、分化，获

14、得无菌培养物，常为单芽、丛芽、愈伤组织、胚状体或原球茎。,继代/增殖培养：隔一定时间，把培养物切割成适宜大小，转移至新鲜培养基上继续培养。 目的：对初代培养获得的无菌培养物进行扩大繁殖或为保存无菌培养物而进行的培养。,生根培养：诱导无根芽苗形成不定根，形成完整植株。,5、培养物的观察、统计与分析,污染率、死亡率、褐变率、愈伤组织诱导率、分化率、生根率、成苗率 外观形态的观察 细胞学观察 生理生化分析 数学统计分析,详细记录，根据生长情况确定进一步实验方法。,培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只

15、有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。 要根据植物的营养原理和植物离体培养的不同要求而人工配置出培养所需要的营养物质。,第三节、培养基的组成及其配制,1、培养基组成,完全培养基,MS基本培养基,（1）无机成分,除C、H、O外，无机物中有12种对于植物的生长是必须的，即N、P、S、Ca、K、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo。其中前6种需要的数量较大，称之为大量元素，后6种需要的数量较小为微量元素。 碘-I 虽然不是植物必需元素，但几乎所有的培养基中都添加I，有些培养基中还加入钴“Co”镍“Ni”等元素，这些元素加入培养基利于植物组织细胞的在离体条件下生长和发育。,大量元素-N、P

16、、K、S 、Ca、Mg 它们是以盐的形式添加到培养基中的，如KNO3、 KH2PO4、 MgSO47H2O、CaCl2等。 作为无机N源，添加到培养基中的有硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）两种形式，硝态氮和铵态氮配合使用，若单独应用硝态氮远优于铵态氮，因硝态氮的培养基易造成碱漂移，加入少量铵盐会抑制这种漂移。 硝酸盐：KNO3、NH4NO3、NaNO3、Ca（NO3）2 铵盐：NH4NO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4,无机成分,微量元素： Fe、Mn、Zn、B、Cu、Mo等多种微量元素 ，以盐的形式供给。 如：MnSO44H2O 、Na2MoO42H2O、CoCl26H2O、K

17、I等。,Fe盐： Fe盐是用量较多的一种微量元素，对植物组织叶绿体的合成和延长生长起重要的作用。因此，单列出来。 培养基中的铁离子，多以螯合铁的形式存在，即EDTA-Na2 与FeSO44H2O混合。,无机成分,主要有两类： 一类是：作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素，如糖类、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺）； 另一类是：一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基（如腺嘌呤等）。,（2）有机化合物,糖 类： 一方面是作为碳源；另一方面，还可以维持培养基中一定的渗透势 。 植物组织培养中

18、常使用蔗糖，其次为葡萄糖和果糖。蔗糖经高温后部分被降解成葡萄糖和果糖。 一般糖的浓度：为2%5%。,氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机N源。 常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 一般使用浓度：1-1000mg/L。,维生素 维生素类直接参加生物催化剂，即酶的形成，以及蛋白质、脂肪的代谢等重要的生命活动。 培养基中的维生素主要是B族维生素，如盐酸硫胺素（维生素B1）、盐酸吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3，又称维生素PP）、泛酸（维生素B5）、生物素（维生素H）、钴胺素（维生素Bl2）、叶酸（维生素B11

19、）、抗坏血酸（维生素C）等。 一般使用浓度：0.110mg/L,肌 醇 化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，肌醇参与磷脂合成、细胞壁果胶的合成，并维持膜系统的活动，它在糖类的相互转化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用。 一般用量：为50100mg/L。,激素在植物体内含量微小，但在植物生长、发育和分化中起重要作用。激素在植物体内存在活化和钝化二种形式，二者间的平衡在调节植物生长、发育和分化中起重要作用。 在离体培养过程中，培养基中附加的外源植物激素类物质对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用，是培养基中的关键物质。,（3）植物激素(plant hormones)

20、,植物激素或生长调节剂（growth regulators）包括： 生长素类（auxin） 细胞分裂素类(cytokinin, CTK) 赤霉素类 (GA) 乙烯（Eth) 脱落酸(ABA) 其中前三者为正向激素，后两者则为负向激素。 常用的主要有生长素类和细胞分裂素类两大类。,生长素类（auxin）：在作用或结构上类似于吲哚乙酸的一类物质的统称。生长素是最早发现的植物激素。,作用：诱导愈伤组织形成，促进细胞的分裂和伸长，诱导根原基的发生和根系的生成，有调运养分的效应。使用浓度0.110mg/L。 常用的生长素有: 吲哚乙酸 (IAA)、 奈乙酸 (NAA)、 2，4，二氯苯氧乙酸 (2,4-

21、D) 吲哚丁酸 (IBA) 。,细胞分裂素类(cytokinin, CTK) ：是一类促进细胞分裂的植物激素，细胞分裂素都为腺嘌呤的衍生物。,作用：促进细胞分裂和分化，诱导不定芽的形成，促进胚状体的发育，延缓组织的衰老，打破顶端优势，有利于芽的增殖，常用于继代和增殖培养。使用浓度0.110mg/L。 常用的细胞分裂素有： 激动素 (KT) 6-苄基腺嘌呤 (6-BA/BAP) 玉米素 （ZT） 异戊烯氨基嘌呤 (2-ip) 噻重氮苯基脲 （TDZ）,（4）其它附加成份,琼脂：0.51。 天然提取物-椰子汁（CM）、马铃薯汁、水解酪蛋白（CH）、 香蕉汁、玉米胚乳、水解乳蛋白（LH）、酵母提取物

22、 (YE)、西红柿汁、苹果汁等。 活性炭 ：0.5 3%，吸附培养过程中产生的有害物质 抗生素：控制微生物的系统侵染 。 硝酸银 ：抑制乙烯活性。,（5）培养基pH值,一般培养基pH值在高压灭菌前调节在5.06.0之间。 pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。 pH值也影响琼脂凝固。,2、培养基种类及其特点,按照培养基用途分类 基本培养基、诱导培养基 继代增殖培养基、分化培养基 壮苗培养基、生长培养基 生产培养基,据培养物的培养过程分为 初代培养基 继代培养基 按照培养基物理状态分类 固体培养基 半固体培养基 液体培养基 固液双层培养基,按照培养基的成分： 高无机盐含量的培养基：M

23、S, LS, BL, BM, ER KNO3含量较高的培养基：B5, N6,SH 中等无机盐含量的培养基：Miller, Nitsch, H 低无机盐含量的培养基：White, WS, HB，HE,MS培养基,1962年由urashige和koog为培养烟草细胞而设计的。 特点：无机盐（如钾盐，铵盐，硝酸盐）含量均较高，微量元素种类较全，浓度也高。其养分的数量和比例较合适，离子平衡性较好，具较强的缓冲能力，培养过程中较稳定，可满足植物的营养和生理需要。其中它的硝酸盐含量较其它培养基为高。 广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。,几种常用基本培养基

24、的特点,6 培养基,1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 特点：3和（4）24 含量高，VB1含量高，不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花粉和花药培养和组织培养。,5培养基,1968年由amBorg等为培养大豆根细胞而设计的。 特点：3含量高，有机物含量较高，但含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,H培养基,1967年由Bourgin和Nitsch为烟草花药培养而设计的。 特点：大量元素约为1/2MS，微量元素减少但含量增加，维生素种类较多。用于多种植物的花药、胚培养。,hi

25、te 培养基,1943年由hite为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作hite改良培养基，提高了g4 的浓度和增加了硼素。 特点：是无机盐浓度较低，有机成分含量也相对较低。适于生根培养。,-培养基,Kao等1975年为原生质体培养而设计的。 特点：有机成分较复杂。它包括了所有的单糖和维生素。广泛用于原生质体和融合体的培养。,3、培养基的配制方法,（1）母液贮备液配制 （2）培养基的制备,（1）母液贮备液配制,在组织培养工作中，配制培养基是日常工作，为了简便起见，将培养基配方中的药品配成一定倍数的浓缩液，用时稀释，这种浓缩液就是母液贮备液。 母液储备液可一次称量供一段时间使用，简单

26、方便，不仅可以提高培养基中微量成份称量的准确性，还可以减少工作量，提高效率。,（1）母液贮备液的配制要求 大量元素母液配制：10 x，20 x，50 x 微量元素母液配制：1000 x 铁盐母液配制： 100 x或200 x , 分别溶解EDTA-Na2 与FeSO44H2O，再充分混匀，贮存在棕色瓶中 有机母液配制：可以分别配制100200X，也可以混在一起配制,肌醇一般单独配置成100 x。 生长调节物质配制：分别单独配制成母液，储存于冰箱。一般浓度为0.11 mgml。并注意不同激素需加入不同助溶剂。 保存：母液均在4下保存，如果发现被污染或有絮状沉淀不能再用。,常用生长调节物质的配制,

27、注意问题： 配制母液时，各种成份应单独分开称量并溶解，再混合。 配大量元素母液时Ca离子盐应避免与SO4和PO4根离子盐同时加入。 配制铁盐母液时，硫酸亚铁不应加热助溶。置棕色瓶中贮存。 注意不同的植物激素选用不同的溶剂助溶后，再用蒸馏水定容。,（2）培养基配制的一般程序, 大量、微量、有机、铁盐母液的量取： 实际吸取母液的量(mL) 配制培养基的体积（mL）/母液中该成分的扩大倍数,蔗糖的称量： 一般培养基中蔗糖浓度为30g/L，既3。 实际称取量（g） 配制培养基的体积（L）浓度30g/L, 琼脂的称量及加热：一般5g/L，加蒸馏水700800ml加热至溶化。 实际称取量（g） 配制培养基

28、的体积（L）浓度5g/L, 激素类物质母液的量取：,实际吸取量(mL), 混合、定容及调节pH值：pH5.65.8 1N的盐酸或NaOH调节pH值, 分装、扎口与灭菌:,要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。,培养基应及时灭菌，防止变质。,为了尽量减少人为的误差，必须严格按上列各个步骤进行操作。应当把培养基中的名种成分都写在纸上，加过去一个以后即划掉一个。 所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养血等都应当清楚地做上标记，这样即使经过高压灭菌和长期贮藏之后也不难识别它们。,4、培养基的选择,基本培养基的筛选：在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛采用的

29、基本培养基开始。 激素的筛选：在离体培养中，激素的应用要根据植物种类、培养阶段等选择适宜的激素种类、激素浓度及配比。 其它成分的筛选：除激素外，培养基中其它成分对培养效果也有影响。离体培养的效果，是一个多因素综合作用的结果，必须根据具体情况合理配比。,5、培养条件,（1）光照 （2）温度 （3）湿度 （4）pH值 （5）渗透压 （6）通气条件,（1）光照,多数培养类型需要光照，一般只需提供弱光或散射光，光照过强抑制培养物的增殖。 光照主要是对植物的形态建成起作用。一般离体根培养、愈伤组织诱导、形成不需要光照，而芽的分化、生长需要光照。,光照强度：一般1000-4000Lux，多2000lux左右，以荧光白质灯管为多。 生根培养阶段，光照强度适当增强。,光质：以荧光白质灯管为光源，光谱成分主要是蓝紫光，波长419467nm。,光照时间：对植物的生长和形态形成、变化有明显影响,大多数情况下为1216小时。,（2）温度 温度通常在1828