车宝泉-液相色谱知识及应用

1、液相色谱知识及应用化学室车宝泉,第一部分:液相色谱简介,HPLC的仪器配置及流程,等度及高压梯度泵系统,由一个或数个高压泵组成 每台泵输送一种溶剂 扩展性强，组合灵活 特点: 一般可耐6000psi反压 流速在0.1到5ml/min 设定范围可低至1l 或高至10ml,低压梯度系统,由一个高压泵组成 单泵可运行梯度 可运行三元或四元梯度 单键盘控制 需要较好的脱气方法 一般要氦气或脱气机脱气,有机溶剂/水的混合物产生高粘度 导致高反压,水与有机溶剂混合时的粘度,1 仪器方面 仪器模块化，一体化， 毛细管HPLC 2. 仪器联用技术发展液相色谱质谱液相色谱核磁共振光谱 液相色谱-气相色谱等,液相

2、色谱进展,3 色谱柱填料 不锈钢, 高分子聚合材料 三氧化二铝 4. 快速分析 采用细内径，提高灵敏度细粒度填料(1-3 m),提高柱效，短色谱柱快速分离新装填方法：整体柱2分内分离10种化合物,第二部分,液相色谱常用的色谱柱,对液相色谱柱的了解,从色谱方法上分： 正相/反相，离子交换，分子体积排除，亲合，疏水回受 从柱子类型上分： 分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合 从柱体积及柱结构上分： 内径 微径柱2mm以下 分析柱3.9-7.8mm 制备柱7.9-50mm 长度5cm-60cm 从柱体材料上分： 不锈钢（普通/可换柱芯），玻璃，聚合物（径向加压）,高效液相色谱柱概况,常见的分配柱填料,液

3、相色谱填料的种类,碳十八柱（ODS/C18） 碳八柱（Octyl/C8） 碳六柱（Hexyl/C6） 碳四柱（Butyl/C4） 碳一柱（Methyl/C1） 常见的吸附柱填料 硅胶柱,阴离子交换柱（SAX） 阳离子交换柱（SCX） 苯基柱（Phenyl） 氨基柱（Amino/NH2） 氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）,不同品牌色谱柱,硅胶的基质不同 主要是硅胶的纯度差异 硅胶纯度越高，性能越好 含碳量不同（C%） 填料的表面积不同（m2/g） 端基封口与否 填料的孔径差异（） 填料的颗粒度差异（）,色谱柱保护,过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 仪器在使用完毕，冲洗整个系统中的缓冲液

4、 柱子不使用时，两端密封保存。 在适当的溶剂中保存色谱柱 注意色谱柱的pH使用范围，不用高压冲洗色谱柱，不再高温下过长时间使用硅胶键合相,第三部分:知识及应用,几个重要概念 液相色谱定性应用 液相色谱定量应用,概念:色谱条件,示例: 用氰基键合硅胶为填充剂；0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液(用20磷酸调节PH值至2.7乙腈(1: 1)为流动相，检测波长为267nm。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达

5、到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求，可在该品种项下注明。,概念:系统适用性实验,理论板数按利血平计算应不低于2000，利血平峰与其它色谱峰的分离度应符合要求。 色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物响应值的重复性是系统适用性试验的重要参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应符合要求；或规定色谱条件下的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。,系统适用性实验,理论板数:（n） 量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2）， 按

6、n5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数，,系统适用性实验,分离度 计算公式为： R= 2(TR2-TR1)/(W1+W2) 式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.5。,系统适用性实验,重复性: 各品种项下的对照溶液，连续进样35次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。 拖尾因子: 为保证测量精度，应检查待测峰的拖尾因子 （T）是否符合各品种项下的规定，,定性方法：,鉴别正反应： 通常在相同色谱条件下，供试品和对照品保留时间的偏差在2以内，则鉴别正反应。 还

7、可通过在供试品中加入对照品，供试品色谱峰无分岔现象来证明。 假阳性: 显色、沉淀 假阴性：检测限因素、样品复杂性干扰,应用实例,1. 食品、保健品中添加枸橼酸西地那非的鉴别。 2. 三七粉中添加 醋酸地塞米松的鉴别。 3. 抗癫痫中药添加苯巴比妥的鉴别。 4. 中药制剂中掺加降糖类西药的鉴别。,单一HPLC鉴别有局限性需结合以上方法可以和薄层色谱，二极管阵列检测器阵列。* 要做到100确定，必须和质谱结合进行,光电二极管矩阵检测器,定量方法：HPLC为首选容量分析、紫外光谱法的局限性实例醋酸地塞米松片：紫外光谱法不法厂家用醋酸泼尼松代替盐酸小檗碱片：滴定法，广东一厂家连续生产掺伪，含大量杂质

8、抗生素,定量方法,标准曲线法，分为外标法和内标法： 外标法 在液相色谱中用得最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用得最多,外标法定量（二）,采集不同浓度标样的色谱图 积分，按外标法定量计算，建立标准曲线,标准曲线,第四部分:HPLC问题的故障排除,故障排除策略综述 机械及化学因素对性能的影响 仪器谱带展宽 系统检测及优化 色谱柱的性能 塔板数，死体积 色谱峰形问题,第二部分 保留时间重现性 温度 有机相比例 pH 离子对 疏水塌陷 方法开发建议 额外的色谱峰（鬼峰）,合理的逻辑判断 将会节省解决问题的时间,色谱问题的可能根源,流动相 进样器 在线过滤器 色谱柱 检测器 样品,泵 保护柱

9、连接管线及接头 积分仪/记录仪/软件,液相色谱对色谱泵的要求,影响液相色谱系统的数据精度的关键 以在任何情况下保持最高精度为目的 稳定平滑并且重现性好的流速 流速的重现性对定性及定量，特别是GPC的分子量分布的测定尤为重要 对压力敏感的检测器，如示差、电导及电化学，特别是粘度检测器的影响很大。与质谱联用时尤为重要 有效的流速范围（制备及微柱实验时考虑） 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合及梯度 滞后体积的合理性（梯度实验时考虑）,简化问题 评估对试验室效率的影响 观察色谱图 尝试分类问题 最先对最容易的部分进行故障排除 ,问题,故障排除的策略,色谱柱 保护柱 流动相 样品/样品瓶问

10、题,泵 进样器 检测器 数据采集,谱带展宽 连接管路 色谱柱 样品瓶,填装良好的色谱柱在系统、连接状况皆良好的状况下，色谱峰形很好,良好的色谱结果,色谱图中所有色谱峰变形,为什么色谱图中的所有色谱峰都变形？ 机械问题 进样器 色谱柱有死体积 连接有问题 化学问题 溶解样品的溶剂太强 其他的综合因素 色谱柱头的污染、部分堵塞,色谱柱内空隙 高反压，扭曲的或双峰,相似的变化,所有色谱峰都变坏的机械问题,所有色谱峰都变坏的机械问题,谱带展宽（Band Spreading）: 被测样品谱带变形/加宽 严重者出现双峰 特点：所有的色谱峰的表现形状相似 展宽是以下两种因素的综合结果： 仪器/系统影响 色谱

11、柱的影响,进样体积 进样器（密封垫问题） 连接管线，特别是： 进样器至色谱柱 色谱柱至检测器 接头及筛板 检测器的检测池体积 色谱柱本身 色谱柱内的死体积 筛板阻塞,注意：谱带最早由进样器产生,注意：这是最常见的问题,柱外谱带展宽的机械因素,下图是用0.04内径的管路连接时测柱效的色谱图： 柱效：4000,上图是用0.009内径的管路连接时测柱效的色谱图： 柱效：1,1000,注：使用相同色谱柱,实例：管线内径对柱效的影响, 在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线,柱头有死体积 - Channeling,填料塌陷,色谱柱本身的问题：柱塌陷,色谱柱塌陷的影响及原因,双峰及前沿峰 所有色谱峰皆受影

12、响 色谱柱自身毁坏，化学伤害 pH 8 硅胶基质被溶解 色谱柱自身毁坏，机械损伤 压力的突然变化、超压 色谱柱中出现裂缝,硅胶溶解,键合相水解,传统硅胶基质填料的pH局限性,注：有时此现象被称为色谱柱流失（“Column Bleed”），当配体水解不断进行时，色谱峰的保留会降低，碱性物质的色谱峰形可能会变差 。,低pH下键合相的水解,色谱峰形欠佳的其它原因,色谱峰形问题：展宽且拖尾的色谱峰 色谱柱进口过滤器（筛板）部分阻塞 卸下接头，清洗或更换筛板 在线过滤器污染 更换筛板 保护柱污染 更换保护柱或柱芯,所有色谱峰都变坏的化学问题,溶解样品的溶剂不正确 洗脱强度比流动相强,色谱图中某些色谱峰变

13、形,为什么得到一个或一些变形的色谱峰? 主要的影响因素是化学问题 某一个样品组分与颗粒表面发生阳离子交换 色谱柱的本身性质或化合物的本身性质所引起的化学问题 样品在色谱柱上过载 样品引起的化学问题 浓度过载 体积过载,这些色谱峰峰形良好,此化合物因化学问题导致拖尾，主要原因是错误地选择了填料或流动相pH,某些色谱峰变坏：化学问题,一些色谱峰峰形很好，但某一个或几个色谱峰峰形差 化学问题（非机械问题） 由于第二种相互作用的发生使碱性物质峰形拖尾，因而导致：积分误差、分离度降低、灵敏度降低,样品与键合相的疏水相互作用,疏水相互作用及 与带电位点的离子交换作用 with Charged Sites,

14、Base,Base,拖尾且在HPLC中保留过长,上述实验使用了两个相同的普通C8色谱柱,HPLC混合模式的保留导致拖尾,Time (min),50,普通 C18,现代 C18 （高纯硅胶）,中性物质,碱性物质,中性物质,碱性物质,0,pH 7,不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异,碱性物质拖尾的解决方案,色谱柱或填料的品牌/流动相的pH值,当上样量超过一定限度时发生 注意峰起点提前，注意：分析与制备之色谱峰的落点位于相同保留时间,色谱柱上的样品浓度/质量过载,常见HPLC问题的故障排除,第一部分 故障排除策略综述 机械及化学因素对性能的影响 仪器谱带展宽 系统检测及优化 色谱柱的性能 塔板数，死体

15、积 色谱峰形问题,第二部分 保留时间重现性 温度 有机相比例 pH 离子对 疏水塌陷 方法开发建议 额外的色谱峰（鬼峰）,保留时间重现性,重现性 流动相比例 温度 pH 离子对 梯度试验的平衡时间,峰漂移 平衡 固定相稳定性 色谱柱污染 疏水塌陷 使用含碳量较高的色谱柱时 使用有机相比例低于5%的流动相时,注意：首先要排除色谱泵的因素！,所有色谱峰保留时间加长或缩短 泵流速问题 检测实际泵流量 体积/时间 错误的色谱柱类型 与C18相比，C8保留较弱。或不同品牌（含碳量不同）的C18柱 温度问题 温度升高，保留变短，温度降低，保留加长 流动相中有机相的比例 有机相比例增加，保留时间降低 有机相

16、比例降低，保留时间增加,保留时间变化,保留时间重现性,非色谱柱因素： 溶剂（有机相）组成 溶剂体积%对保留因子k有指数关系的影响 溶剂组成每变化1%，保留时间变化5%到15% 在使用含碳量较高的色谱柱、流动相中含有大量水相时，产生键合相疏水塌陷的现象,流动相配制,应清楚明确地指明流动相的配制方法 指明：是将甲醇加入到水中，还是将水加入到甲醇中，抑或是分别用量筒量出一定量的甲醇及水倒入另一容器中 pH测量：应该在加入有机相之前测量pH 当温度波动时，用溶剂称重的方法会使配比更精确些,保留时间变化,有些色谱峰保留时间加长或缩短 化学问题 梯度的平衡时间不足 色谱柱的类型不对，与C18相比，CN的选

17、择性有差异；或色谱柱的品牌不对 pH不正确或缓冲液没有缓冲能力 流动相中有机相的比例不对，或有机溶剂的类型不对,保留时间重现性：pH,非色谱柱因素 中性物质：无影响 酸性物质：pH增加，保留降低 碱性物质：pH增加，保留提高降低 有时；流动相有0.1pH值的变化，会导致高达10%的保留时间变化 流动相pH在样品的pKa值的1之内保留时间变化最大,pH,容量因子 (k),酸性物质未电离酸,离子化的酸, 2 pH 单位 = 99% 未离子化,+ 2 pH单位= 99% 离子化,pKa, 2 pH 单位以外可获得更稳定的保留 (重现性更好),稳定区域：方法稳定性更好,保留时间重现性,非色谱柱因素：

18、离子对试剂（例如：己烷磺酸 PIC B6） 对保留时间的影响 在低浓度下，离子对试剂浓度增加，保留增加 在高浓度下，离子对试剂的浓度对保留几乎无影响 需要长时间的平衡 由于固定相吸附试剂（平衡可能需要使用多达500个柱体积的流动相）,使用离子对流动相的色谱柱 明显需要较长的平衡时间 因为，一般在一个色谱柱中： 1 mol/m2 300 m2/g 2 g 表面覆盖率 硅胶表面积 色谱柱中的填料量 覆盖此色谱柱需要相当于600moles的离子对试剂，如果流动相中PIC试剂的浓度是每升1mM，就需要600ml溶剂 在1ml/min流速下，需要600分钟（10小时）,离子对法的平衡,样品中不含有离子对试剂,离子对色谱比较常见的现象 负峰，主要原因是样品溶剂的问题,负峰（等度色谱）,疏水塌陷,当使用有机相比例较低的流动相（极性较高的）时，观察到保留完全丧失的现象 使用含碳量较高的色谱柱时经常发生 实例：使用100%水溶液流动相，进样77针，运行时间超过20小时，保留时间皆比较稳定 但当停止流速后，重新再加上流速时，保留丧失。此现象表明：当色谱柱卸压时，流动相被排出孔,停止输液时，迫使水相流动相进入孔中的压力降低为零。压力降低时，疏水的孔表面会排斥极性流动相，使孔中不浸润 “dewe